Good afternoon.
It's a pleasure to be here.
X-ray crystallography plays a major role in my lecture, as it did in not few others at this conference.
So let me therefore spend a few minutes on the history of this method and technique,
also because last year, in 2012, we celebrated the Laue centennial
and because X-ray crystallography and X-rays are a gift of Bavaria, my home country, to the world.
This is the first X-ray photograph taken by Laue of a crystal - it's indeed an ugly diffractogram.
But it meant a revolution of chemistry and later biology, giving molecules a face.
We for the first time had now a method in hands to see molecules.
This was Laue's publication, June 1912, in the 'Berichte der Bayerischen Akademie der Wissenschaften',
a journal with impact factor close to zero, yet it led to a Nobel Prize 2 years later.
I just would like to praise the Swedish Academy, that they do not count impact factors but they looked at the facts.
This is Laue on the third Lindau meeting 1953 where he showed his object of research, a crystal lattice, to Count Bernadotte.
The founding fathers of X-ray diffraction:
here is Röntgen who had discovered the X-rays in Würzburg, a northern part of Bavaria,
who was in Munich at the same time when Laue was there as an assistant of Arnold Sommerfeld, the theoretical physicist.
Röntgen was Professor of Experimental Physics at the Ludwig Maximillian University in Munich.
These are the original apparatuses which you find on display in Munich at the Deutsche Museum -
have a look at it, it's fascinating.
Now the rumour of Laue's experiment came to England just a few months later
and they were taken up immediately by father and son Bragg - this is Lawrence, Bragg's son.
They, being chemists, immediately grasped the potential of this method to do chemistry,
to analyse crystals first and then molecules.
This was their first crystal structure of a simple sodium chloride.
They were given a Nobel Prize in 1950, just a year later for this discovery.
And they founded a school, Cambridge UK, which then culminated with the discovery of protein crystal structure analysis.
The discovery of a method to allow that was made by Max Perutz, again a Nobel laureate.
Growth of biological crystallography.
Now I started protein crystallography as a youngster in '68 or so.
These are the numbers of determined protein structures, almost zero at that time, less than a handful.
And then slow growth until about 1990, when we see an exponential increase.
Why - because of the technological advances that have been made.
No time to talk about the recognition that biology...an understanding of biology needed to see the molecules
There seemed to be a problem.
The problem were membrane proteins which were thought to be non-crystallisable
until this barrier was overcome by the analysis of the photosynthetic reaction centre.
This of a purple bacterium, this yeasty bacterium.
These are the crystals in high resolution X-ray diffraction.
Again a relatively slow progress, about a decade.
But now we begin to see high resolution:
most exciting membrane protein crystal structures in the top journals.
They are in fact quite important because membrane proteins control most processes in cells.
And they are the favourite targets for drug design.
You heard the most recent advance in the lecture of Kobilka about the beta2 adrenergic G-protein-coupled receptor -
it's a beautiful story.
That will continue.
We obviously have learned how to deal with membrane proteins.
Now this is the theme of my lecture:
the life cycle of proteins.
Protein synthesis, ribosome.
Again crystallography that helped us to understand - you heard Ada Yonath's lecture.
Protein folding.
Huge containers that help to fold proteins that do not fold fast enough spontaneously.
And that is protein degradation - my story this afternoon.
Surprising observation is that we found a huge diverse family of proteinases in the living world,
such that about 3% of all genes encode proteolytic enzymes - despite the fact that it is such a simple hydrolytic reaction.
If you boil proteins with acid then the same thing, hydrolysis of peptide bond, happens.
Why do we need so many?
We need so many, we need so diverse molecules because proteolysis...limited proteolysis is a major regulatory mechanism,
probably as important as phosphorylation and dephosphorylation.
This cartoon shows what we have found in 4 decades or so of structural studies of proteases and their natural inhibitors,
because protease regulation is quite essential.
If my proteases would not be properly regulated, I would disappear in front of you to my bones within this half hour.
And so it is with all the organisms.
So we need a very tight and precise regulation.
And what we did during these 4 decades or so was studying different regulatory mechanisms in proteases.
This cartoon shows it - I will go through it, but show with examples only 2 of these mechanisms.
The first one is the very simple inhibition.
There is a protease inhibitor with a shape that perfectly fits the green enzyme substrate binding site.
And this was the first example in the early '70s.
This is trypsin, the digestive enzyme, and this is its natural basic pancreatic trypsin inhibitor.
You see a quite complex binding surface, but there is no structural change.
They are made for each other perfectly.
So when we look at the individual components by crystallography and the complex, we see no structural change - perfectly matched.
Many, many dozens of natural inhibitors of trypsin-like enzymes have been found.
They all bind in very similar ways.
Some have additional binding sites to exocytes to enhance specificity and activity.
We looked at the papain-like proteinases, found the same thing with their natural inhibitors.
Or the metalloproteinase.
Let me just show a few examples of this family because it has quite some importance in drug design and development.
This is a complex of a mammalian metalloproteinase
and it sticks its N-terminus into the molecule, coordinated by the amino group, the active site zinc.
Now these are the many physiological and pathological processes in which metalloproteinases are involved.
So no doubt that this is of major interest for pharma development.
And in fact the synthetic inhibitors that have been made for the metalloproteinase
in a way simulate what one sees with the natural inhibitors.
This is a short peptide.
This is its amino group which now has been modified to a hydroxamic acid,
which is a much better ligand to the zinc-coordinating ligand.
But the problem is also displayed on this slide,
because there are at least 2 dozen of metalloproteinases, all with different roles in health and disease.
And we have to target a specific one with a certain compound and that is difficult, because they all look very much the same.
Nature is much more clever.
This is another example of now thrombin inhibitors - thrombin is a trypsin-like serine protease.
And these nasty blood sucking animals are practically bags full of clotting inhibitors,
because they only can digest liquid blood, fluid blood; if it coagulates they would die.
So nature has endowed them with extremely powerful thrombin inhibitors, which we had analysed for these...
this is a tick, this is a leech, this is a bug.
Hirudin, actually, is an approved anticoagulant drug.
And even modifications of it, these...
modifications by which just the C-terminus of the hirudin is used and linked with a chemical that attacks the active site;
also this is in development, and partly in the clinic.
Now what more mechanisms did we see?
I just go through this cartoon.
So we see proteases of exquisite specificity.
We see that most proteinases are made as proenzymes and require a limited proteolysis and cleavage of usually an N-terminal piece
to allow access to the active site.
But there are other cases where this limited proteolysis step leads to an allosteric change of the protease,
and only that form is proteolytically active.
So we have examples of both of these.
We do have membrane-anchored proteases; all the clotting enzymes in our blood system are of this kind.
They also, of course, turn over preferentially membrane-anchored substrate.
So in this way the activity is limited to 2 dimensions, to the vessel surface.
We do have co-factors, this blue object.
They bind to the enzyme, do nothing to it; but they offer a new binding site for the substrate.
And only with that help, the substrate is stably bound and can be processed.
Examples for that are available.
But also the cofactor may allosterically change the enzyme.
And only this changed conformation is enzymatically active.
So all of these we saw in this long period of structural studies.
So now we'll focus on the...
what I think now interests me most are those intercellular proteases that have their active sites buried inside the molecule.
And access to the active site is possible by opening an entry port.
So this occurs in 2 forms:
a latent form which is practically inactive, and an active form with an open entry port.
And I hope there is time for the last example.
That was a novel mechanism that we saw by structural studies,
where the substrate activates the enzyme in an allosteric manner and at the same time forms a cage around it, so it oligomerises.
So the first example is the proteasome.
You heard Hershko speaking about the ubiquitin conjugation pathway.
Now the executioner is of this pathway - the protease then degrades these labelled proteins - is the proteasome.
That consists of a core particle, this is where we have the very high resolution detailed structures, and a regulatory cap.
Proteasome has other functions:
it recognises and degrades denatured proteins - it's a base cleaner, a very important one.
And if these proteins are foreign, let's say a virally infected cell, then the product of the proteasome degradation
to trigger the T-cell immune response.
There is no T-cell immune response without the proteasome.
Now this is the structure.
First we looked at a simple version, an archaeal version of the proteasome, and found its architecture
the alpha and the beta which are then oligomerised by using symmetry, a 7-fold symmetry and 2-fold symmetries.
And then later we of course looked at the eukaryotic version,
first yeast and then later mammalian, mouse, and found the same architecture but much more complex chemistry
because here all the alphas are different and all the betas are different.
That's a wonderful example how evolution works.
It had available the primitive basic architecture and then it started to vary, to differentiate for regulatory purposes.
So this is a cartoon showing what we know about the regulatory cap.
many sub units which have to do with ubiquitin recognition, with ubiquitin cleavage,
with the unfolding of the substrate chain which is an ATP dependent process, and the opening of the core particle.
I show a few slides of that later.
What do we know of that?
There is no crystallography now available of the regulatory particle,
but there is beautiful electron microscopy coming up by this group - beautiful work, worth to read - and by other groups,
showing the arrangement of these mini subunits, and even, at low resolution, their shape.
Of course, we sooner or later would need high-resolution crystallography,
but there is still some way to go because of crystallisation problems.
Now back to the core particle.
Here you see the yeast core particle with the active sites located inside.
And you see already that it is a closed particle; we'll come back to that later, no time to describe any detail there.
But what stimulated the interest in the proteasome very much was the discovery by an American pharma group
that these boronic acids offer a new strategy to fight cancer, and in particular blood cancer.
It was clear by them, and then we did the crystallography with this compound, that it targets the proteasome.
I forgot to say that - well I should do it right now:
the proteasome is an N-terminal threonine protease, so its N-terminus is the essential active site.
This boronic acid esterifies the threonine.
This was an exciting new strategy for cancer therapy and a big success on the market.
And, not surprising, it stimulated intense research all around the world, screening libraries,
and particularly screening natural compound libraries.
Once these people were successful they sent their compounds to us to look at them, how they bind to the proteasome.
This is just a very small collection.
What you see, however, in yellow, these are natural compounds.
Very different chemistry, these are lactones.
This is an aldehyde.
This is an unsaturated amide bond.
Now they all bind covalently to the N-terminal threonine.
Epoxomicin binds covalently to the threonine hydroxyl and the amino terminus.
Well, these structures started then showed unpredicted variations in binding sites, and surprises in chemistry as well.
I don't think that you can see that, but this salinosporamide is a variant of this simpler omuralide.
A beta-lactone, it acylates the N-terminal threonine of course, but here is a chloroethylene group.
And once, after acylation, the hydroxyl group of the lactone becomes available,
it reacts with it and fuses and forms a tetrahydrofuran ring, thus making the interaction absolutely irreversible.
This is another discovery which we made by chance:
an approved lipoxygenase inhibitor actually is a very strong inhibitor of the proteasome,
noncovalent but offering new avenues for further development.
So this is the discovered proteasome inhibitors grouped...some of them grouped according to their chemistry;
you find aldehydes, you find beta lactones, you find boronic acids, you find non peptides, cyclic peptides and what have you.
So a Who's Who of inhibitors that are being worked on in many laboratories right now.
Just one example of the discovery of a new chemical entity that we made some years ago through cooperation with plant biologists.
They had found that this bean plant pathogen needs a virulence factor.
And this virulence factor, it secretes...has this formula.
So it's an unsaturated amide bond.
We found that it binds to the proteasome covalently a Michael addition.
And in vivo it shows that in these bean plant cells cyclin B1 polyubiquitinated accumulates.
So the proteasome, the plant proteasome no longer works.
And therefore the cells go into apoptosis.
So this is of course...was a new chemical entity and again synthesised by chemists and modified in various ways.
Another - I see time is progressing - that is the constitutive proteasome,
and this was the target for most of or all of the activities so far,
is an approved cancer target, but it shows very serious pathogenicity, neuropathogenicity.
In immune cells a variant of the proteasome is made which is called immunoproteasome, which is extremely similar:
it has all the 28 subunits, identical, except the 2 x 3 subunits which are responsible for the catalytic activity.
So it changes.
The specificity is somewhat changed, and the immune proteasome makes more MHC class I ligand molecules.
The interest in this is now
that we could avoid by targeting just the immunoproteasome the toxicity of the constitutive proteasome inhibitors.
And it offers a new strategy against autoimmune disorders, because we specifically block the immune system.
Well, I'll skip that, I see time runs by.
And say a few words about the novel activation and inhibition mechanism that we saw in the DegS.
There is activation by the substrate itself, and there is oligomerisation - that was a new principle.
The HtrA/DegS are a huge family found ubiquitously.
They all consist of a protease domain, which is trypsin-like, and PDC domains.
These are protein-protein interaction models.
The DegS play a role in all organisms and in all cell types - this is just an example of the plant chloroplast -
because the DegS are responsible for degrading the D1 protein.
What is D1 and D2?
D1 and D2 are the central components of photosystem II.
This is where the chlorophylls are bound; this is where the reaction happens.
This is D1, D2.
This is photosystem II, recently analysed.
This is our bacterial reaction centre.
The core of the particle is identical in bacteria and in plants.
Plants do have many more accessory, regulatory proteins.
But this is where the thing happens, the primary step in photosynthesis; this is where chlorophylls are bound.
And the exciting observation many years ago was
that of these 2 almost symmetrical L and M, or D1, D2, subunits with their bound chlorophyll
only the L sub unit is catalytically active; electron transfer happens only in L or D1.
So it's not surprising that D1 is particularly vulnerable to stress because electron transfer in organic material generates radicals.
And so the DegS then take care of, they recognise unfolded D1 and remove it.
But it is still surprising that this essential component of a plant, namely its photosystem, has a turnover of less than 1 hour.
Now in mammalian cells and here in bacteria.
So the DegS play a role in stimulating the stress genes - no time to talk about that.
But the simple...more simple mechanism that we found there is that of DegP hexamer
which screens the periplasmic space for unfolded proteins, and in particular unfolded outer membrane proteins.
How does it look like?
The first structure we determined some years ago, the apo structure
Already showing that it is a highly flexible arrangement.
That is we found 2 forms:
an open form and a closed form.
The central core, which is the trypsin-like core which forms the trimer, is unchanged,
but the PDC domains are mobile and they may either form a closed or an open structure.
The essential experiment just was a large array of experiments so displayed here.
asBut I would like to point out just one which set the analysis in motion:
that was gel chromatography.
So of incubating DegP hexamer with casein, which is a good substrate,
and then looking at the gel chromatogram, the sizing chromatogram, after 1 minute - this was the trick:
who does a chromatography after 1 minute incubation?!
But this showed the key to everything that followed.
After 1 minute you see casein but you do not see the hexameric DegP but instead you see a 24-mer.
And that, as I said, set in motion this whole set of experiments to find out what it is.
We were able to isolate the 24-mer which forms a beautiful cage -
think of a cube and each of these 8 vertices of the cube there sits a trimer of trypsins and the PDC domains then fill the rest.
So it's a huge cage, comparable in size to, or even larger than, GroEL.
Now I made this comparison for a purpose.
Because it turns out that these oligomers of DegP are not only proteases but they are also chaperones.
They also form not only 24-mers but also 12-mers.
I am close to the end.
Why electro-microscopy which we can interpret in atomic terms?
Because we have the exact crystal structures of the components.
We see a lysozyme binding in here.
So what is the trigger?
The trigger is the C-terminus of the OMP, which is not available in a healthy protein.
But when it sticks out then this is a sign for disease of this protein, it's not functional, and this triggers then the DegP;
the oligomerisation and the structure change in the molecule making it active.
This is a summary of this last part.
You do have an unfolded OMP.
You do have the inactive hexameric DegP but the unfolded OMP shows a signal.
It shows its C-terminus exposed which causes then oligomerisation.
So it forms a shell around its target.
Now what happens?
Does it have a chance?
We know that the DegS do have chaperone function - obviously they have a chance.
They have a chance when they are able inside this cage to incorporate their exposed C-terminus into their own body.
So the decision between life and death of the protein is made somewhere.
And probably the deciding factor is the degree of damage.
If it's very damaged then it can't refold, and then it's degraded.
This is Munich.
I mentioned the Deutsche Museum where Röntgen's and Laue's machines are on display.
And this is the Munich University; this is where Laue worked and began crystallography, gave chemistry and then biology a face.
Thank you.
Applause.
Guten Tag.
Es ist mir eine Freude, hier zu sein.
Kristallografie mit Hilfe von Röntgenstrahlen spielt eine wichtige Rolle in meinem Vortrag,
so wie auch bei einigen anderen auf dieser Konferenz.
Lassen Sie mich daher ein paar Minuten für die Geschichte dieser Methode und Technik aufwenden, auch deshalb,
weil wir im letzten Jahr, im Jahr 2012, die von Laue-Hundertjahrfeier begingen
und weil die Kristallografie mit Hilfe von Röntgenstrahlen
und die Röntgenstrahlen ein Geschenk Bayerns, meines Heimatlands, an die Welt sind.
Dies ist die erste Röntgenaufnahme, die von Laue von einem Kristall machte – tatsächlich ein hässliches Diffraktogramm.
Aber es bedeutete eine Revolution der Chemie und später der Biologie, indem es Molekülen ein Gesicht gab.
Zum ersten Mal hatten wir nun eine Methode in der Hand, um Moleküle zu sehen.
Dies war von Laues Publikation, vom Juni 1912, in den „Berichten der Bayerischen Akademie der Wissenschaften“,
einer Zeitschrift mit einem Impact-Faktor von fast Null – dennoch führte sie zwei Jahre später zu einem Nobelpreis.
Ich möchte gerne die Schwedische Akademie dafür loben, dass sie keine Impact-Faktoren zählten, sondern auf die Fakten schauten.
Das ist von Laue, auf der dritten Tagung in Lindau 1953,
wo er seinen Forschungsgegenstand, ein Kristallgitter, dem Grafen Bernadotte zeigte.
Die Gründungsväter der Röntgenbeugung: Hier ist Röntgen, der die Röntgenstrahlen in Würzburg, einem nördlichen Teil von Bayern,
entdeckt hatte und der sich in München zur selben Zeit aufhielt,
als von Laue dort Assistent von Arnold Sommerfeld, dem theoretischen Physiker, war.
Röntgen war Professor für Experimentelle Physik an der Ludwig-Maximilians-Universität in München.
Diese sind die Original-Apparaturen, die Sie in München im Deutschen Museum ausgestellt finden können
Die Gerüchte um von Laues Experiment erreichten England nur wenige Monate später
und wurden sofort von Vater und Sohn Bragg aufgenommen – dies ist Lawrence, Braggs Sohn.
Als Chemiker begriffen sie sofort das Potenzial dieser Methode, Chemie zu betreiben
Dies war ihre erste Kristallstruktur eines einfachen Natriumchlorids.
Sie erhielten 1950, nur ein Jahr später, einen Nobelpreis für diese Entdeckung.
Und sie gründeten, in Cambridge in Großbritannien, eine Schule,
die in der Entdeckung der Strukturanalyse von Protein-Kristallen kulminierte
Die Entwicklung der biologischen Kristallografie.
Ich begann mit der Kristallografie von Proteinen als junger Mann im Jahr 1968 oder so.
Dies ist die Zahl der ermittelten Protein-Strukturen, fast Null zu jener Zeit, weniger als eine Handvoll.
Und dann ein langsamer Zuwachs bis ungefähr 1990, wo wir ein exponentielles Wachstum beobachten.
Warum?
Ich habe keine Zeit, um über die Erkenntnis zu sprechen, dass Biologie ...
ein Verständnis von Biologie, das erforderlich ist, um die Moleküle zu sehen
und dann [gab es] später die Anwendungen in der Medizin.
Es schien ein Problem zu geben.
Das Problem waren die Membranproteine, die man für nicht-kristallisierbar hielt,
bis dieses Hindernis durch die Analyse des fotosynthetischen Reaktionszentrums überwunden wurde
Dies sind die Kristalle in hochauflösender Röntgenbeugung.
Wiederum ein ziemlich langsamer Fortschritt, ungefähr über ein Jahrzehnt.
Aber nun beginnen wir, eine hohe Auflösung zu sehen:
die spannendsten Kristallstrukturen von Membranproteinen in den Top-Zeitschriften.
Sie sind in der Tat ziemlich wichtig, denn Membranproteine steuern Prozesse in den Zellen.
Und sie sind die bevorzugten Targets für die Konzeption von Arzneimittelwirkstoffen.
Sie haben von den jüngsten Fortschritten im Vortrag von Kobilka über den G-Protein-gekoppelten Beta-2-Adrenorezeptor gehört
Offensichtlich haben wir gelernt, wie man mit Membranproteinen umgeht.
Dies ist jetzt das Thema meines Vortrag: der Lebenszyklus von Proteinen. Proteinsynthese, Ribosome.
Wieder war es die Kristallografie, die uns verstehen half – Sie haben den Vortrag von Ada Yonath gehört.
Proteinfaltung.
Große Container, die bei der Faltung von Proteinen behilflich sind, die sich nicht von sich aus schnell genug falten.
Und das ist der Proteinabbau – meine Geschichte für diesen Nachmittag.
Die überraschende Beobachtung ist, dass wir eine große und vielfältige Familie von Proteinasen in der belebten Welt vorfanden
trotz der Tatsache, dass es sich um eine solch einfache hydrolytische Reaktion handelt.
Wenn Sie Proteine mit Säure aufkochen, passiert dasselbe – die Hydrolyse von Peptidbindungen.
Warum brauchen wir so viele?
Wir brauchen so viele, wir brauchen so unterschiedliche Moleküle, weil die Proteolyse ...
die begrenzte Proteolyse einer der wichtigsten Regulierungsmechanismen ist,
wahrscheinlich so wichtig wie die Phosphorylierung und die Dephosphorylierung.
Dieser Cartoon zeigt, was wir in ungefähr vier Jahrzehnten der Untersuchung der Strukturen von Proteasen
und ihren natürlichen Inhibitoren entdeckten, denn die Regulierung von Proteasen ist von essenzieller Bedeutung.
Wenn meine Proteasen nicht korrekt reguliert wären,
würde ich vor Ihren Augen verschwinden und innerhalb dieser halben Stunde bis auf die Knochen zerfallen.
Und so verhält es sich mit allen Organismen.
Wir brauchen also eine sehr straffe und präzise Regulierung.
Und was wir in den ungefähr vier Jahrzehnten taten, war,
dass wir die verschiedenen Regulationsmechanismen bei Proteasen untersuchten.
Dieser Cartoon stellt das dar – ich werde sie durchgehen, aber Beispiele nur für zwei dieser Mechanismen zeigen.
Der erste ist die sehr einfache Inhibition.
Da ist ein Protease-Inhibitor mit einer Form, die perfekt auf die grüne Enzym-Substrat-Bindungsstelle passt.
Und dies war das erste Beispiel in den frühen 1970er Jahren.
Das ist Trypsin, das Verdauungsenzym, und das ist sein natürlicher basischer pankreatischer Trypsin-Inhibitor.
Sie sehen eine ziemlich komplexe Bindungsoberfläche, aber es gibt keine Strukturänderung.
Sie sind perfekt füreinander geschaffen.
Wenn wir uns also mithilfe der Kristallografie die einzelnen Komponenten und den Komplex anschauen,
sehen wir keine Strukturänderung – perfekt aufeinander abgestimmt.
Viele, viele Dutzende natürlicher Inhibitoren von Trypsin-ähnlichen Enzymen wurden entdeckt.
Sie alle binden auf sehr ähnliche Art und Weise.
Manche haben zusätzliche Bindungsstellen, zwei externe Bindungsstellen (exocites), um Spezifität und Aktivität zu verstärken.
Wir haben uns die Papain-ähnlichen Proteinasen angeschaut und bei ihren natürlichen Inhibitoren dasselbe entdeckt –
oder bei den Metalloproteinasen.
Lassen Sie mich nur ein paar Beispiele dieser Familie zeigen,
denn sie hat ziemlich große Bedeutung bei der Konzeption und Entwicklung von Arzneimittelwirkstoffen.
Dies ist ein Komplex einer bei Säugetieren vorkommenden Metalloproteinase – dies ist der aktive Bereich, Zink –
und das ist sein Inhibitor – er umarmt sozusagen sein Target – und er steckt seinen N-Terminus in das Molekül hinein,
koordiniert von der Aminogruppe, dem aktiven Bereich, Zink.
Dies sind nun die vielen physiologischen und pathologischen Prozesse, an denen Metalloproteinasen beteiligt sind.
Daher besteht kein Zweifel, dass dies von großem Interesse für die Pharma-Entwicklung ist.
Und tatsächlich simulieren die synthetischen Inhibitoren, die für die Metalloproteinasen entwickelt wurden,
auf gewisse Art und Weise das, was man bei den natürlichen Inhibitoren sieht.
Dies ist ein kurzes Peptid.
Das ist seine Aminogruppe, die nun zu einer Hydroxamsäure modifiziert wurde,
welche ein sehr viel besserer Ligand für den Zink-koordinierenden Liganden ist.
Aber das Problem ist auch auf dieser Folie dargestellt, denn es gibt mindestens zwei Dutzend Metalloproteinasen,
alle mit verschiedenen Rollen bei Gesundheit und Krankheit.
Und wir müssen eine ganz spezifische mit einer bestimmten Verbindung als Target ins Visier nehmen, und das ist schwierig,
denn sie sehen alle ziemlich gleich aus.
Die Natur ist sehr viel klüger.
Dies hier ist ein anderes Beispiel von Thrombin-Inhibitoren – Thrombin ist eine Trypsin-ähnliche Serinprotease.
Und diese widerwärtigen blutsaugenden Tiere sind praktisch Beutel voll mit Blutgerinnungs-Inhibitoren,
denn sie können nur flüssiges Blut verdauen, fließendes Blut; wenn es gerinnt, würden sie sterben.
Die Natur hat sie daher mit wirkungsvollen Thrombin-Inhibitoren ausgestattet, die wir auf diese hier analysieren ließen ...
das ist eine Zecke, das ist ein Blutegel, das ist eine Wanze.
Hirudin ist in der Tat ein zugelassenes gerinnungshemmendes Medikament.
Und es gibt sogar Modifikationen davon, diese ...
Modifikationen, bei denen nur der C-Terminus des Hirudin verwendet und mit einer Chemikalie verbunden wird,
die den aktiven Bereich angreift.
Dies befindet sich in der Entwicklung und zum Teil auch in der Klinik.
Welche weiteren Mechanismen sahen wir?
Ich werde einfach diesen Cartoon durchgehen.
Wir sehen Proteasen von exquisiter Spezifität.
Wir sehen, dass die meisten Proteinasen als Pro-Enzyme aufgebaut sind
und eine begrenzte Proteolyse und die Abspaltung üblicherweise eines Stücks des N-Terminals benötigen,
um Zugang zu dem aktiven Bereich zu ermöglichen.
Aber es gibt andere Fälle, bei denen dieser begrenzte Proteolyse-Schritt zu einer allosterischen Änderung der Protease führt,
und nur diese Form ist proteolytisch aktiv.
Wir haben Beispiele für beides.
Wir haben in der Membran verankerte Proteasen – alle Gerinnungsenzyme in unserem Blutkreislauf gehören zu dieser Art.
Auch sie setzen selbstverständlich die bevorzugt in der Membran verankerten Substrate um.
Auf diese Weise ist die Aktivität auf zwei Dimensionen begrenzt, auf die Gefäßoberfläche.
Wir haben Kofaktoren, dieses blaue Objekt.
Sie binden an das Enzym, sie machen nichts damit, aber sie stellen eine neue Bindungsstelle für das Substrat zur Verfügung.
Und nur mit dieser Hilfe wird das Substrat stabil gebunden und kann weiterverarbeitet werden.
Dafür sind Beispiele verfügbar.
Der Kofaktor kann aber auch das Enzym allosterisch verändern.
Und nur diese Änderungskonformation ist enzymatisch aktiv.
Wir sahen also all diese in dieser langen Phase der Strukturuntersuchungen.
Wir werden uns daher jetzt konzentrieren auf ...
was mich, glaube ich, jetzt am meisten interessiert, sind jene interzellularen Proteasen,
deren aktive Bereiche im Inneren des Moleküls verborgen sind.
Der Zugang zum aktiven Bereich wird möglich, indem eine Eintrittsöffnung aufgemacht wird.
Dies geschieht in zwei Formen: in einer latenten, die praktisch inaktiv ist, und einer aktiven mit einer offenen Eintrittsöffnung.
Ich hoffe, dass wir Zeit für das letzte Beispiel haben.
Dies war ein neuer Mechanismus, den wir anhand von Strukturuntersuchungen zu sehen bekamen
und bei dem das Substrat das Enzym auf allosterische Art und Weise aktiviert und zur selben Zeit einen Käfig um es herum bildet
Das erste Beispiel ist das Proteasom.
Sie haben gehört, was Hershko über den Ubiquitin-Konjugationspfad sagte.
Der Scharfrichter dieses Pfads – die Protease baut dann diese markierten Proteine ab – ist das Proteasom.
Es besteht aus einem zentralen Partikel – an dieser Stelle haben wir die sehr hoch aufgelösten, detaillierten Strukturen
Das Proteasom hat andere Funktionen: Es erkennt denaturierte Proteine und baut sie ab
Und wenn diese Proteine fremd sind, sagen wir, eine von einem Virus infizierte Zelle,
dann besteht das Produkt des Proteasom-Abbaus – es gibt viele Peptide – in Antigenen,
die in einem Komplex mit MHC-Klasse 1-Molekülen zur Zelloberfläche transportiert werden, um die T-Zellen-Immunantwort auszulösen.
Es gibt keine T-Zellen-Immunantwort ohne das Proteasom. Dies ist nun die Struktur.
Zuerst schauten wir uns eine einfache Version, eine in Urbakterien vorkommende Version des Proteasoms an und stellten fest,
dass seine Architektur – es ist ein großes Molekül mit 28 Untereinheiten – chemisch einfach war, und zwar in dem Sinne,
dass es nur zwei Arten von Untereinheiten besitzt: die Alpha- und Beta-Untereinheiten,
die mittels Symmetrie oligomerisiert werden, eine 7-fache Symmetrie und 2-fache Symmetrien.
Später schauten wir uns selbstverständlich auch die eukaryotische Version an,
zunächst Hefe und dann später die Version bei einem Säugetier, bei der Maus, und fanden dort dieselbe Architektur vor,
aber mit einer sehr viel komplexeren Chemie, denn hier sind alle Alphas und alle Betas unterschiedlich.
Das ist ein wunderbares Beispiel dafür, wie die Evolution arbeitet.
Sie hatte die primitive, grundlegende Architektur zur Verfügung und begann dann zu variieren,
aus Gründen der Regulierung zu differenzieren.
Das ist ein Cartoon, der darstellt, was wir über den regulierenden Deckel wissen.
mit der Spaltung von Ubiquitin, mit der Entfaltung der Substrat-Kette,
die ein ATP-abhängiger Prozess ist, und der Öffnung des zentralen Partikels.
Ich zeige später ein paar Folien davon. Was wissen wir darüber?
Es gibt zur Zeit keine Kristallografie des regulierenden Partikels,
aber es wird wunderbare Elektronenmikroskopie von dieser Gruppe geben – wunderbare Arbeit, lesenswert –
und von anderen Gruppen, welche die Anordnung dieser Mini-Untereinheiten und sogar,
bei niedriger Auflösung, deren Gestalt darstellt.
Natürlich würden wir früher oder später hochauflösende Kristallografie benötigen,
aber da liegt noch ein längerer Weg vor uns – wegen Problemen bei der Kristallisation.
Nun zurück zum zentralen Partikel.
Hier sehen Sie das zentrale Partikel der Hefe, mit den aktiven Bereichen im Inneren.
Und Sie sehen bereits, dass es ein geschlossenes Partikel ist – wir werden später darauf zurückkommen,
jetzt haben wir keine Zeit, um hier irgendwelche Details zu beschreiben.
Aber was das Interesse am Proteasom in hohem Maße förderte, war die Entdeckung einer amerikanischen Pharma-Gruppe,
dass diese Boronsäuren eine neue Strategie zur Verfügung stellen, Krebs zu bekämpfen, insbesondere Blutkrebs.
Für sie war klar – und dann untersuchten wir mit Hilfe der Kristallografie diese Verbindung –,
dass sie auf das Proteasom als Target abzielt.
Ich vergaß zu erwähnen, dass – das sollte ich jetzt sofort tun – dass das Proteasom eine n-terminale Threonin-Protease ist,
somit ist sein N-Terminus der wesentliche aktive Bereich.
Diese Boronsäure verestert das Threonin.
Das war eine spannende neue Strategie für die Behandlung von Krebs und ein großer Erfolg auf dem Markt.
Und stimulierte – was nicht verwunderlich ist – eine intensive Forschungsaktivität auf der ganzen Welt,
das Screening von Bibliotheken, vor allem von Bibliotheken natürlicher Verbindungen.
Wenn diese Leute dann Erfolg bei ihrer Suche hatten, schickten sie uns ihre Verbindungen,
damit wir sie uns anschauten, wie sie an das Proteasom banden.
Dies ist nur eine sehr kleine Kollektion.
Was Sie allerdings hier in gelb sehen, sind natürliche Verbindungen.
Sehr unterschiedliche Chemie, diese sind Laktone.
Das ist ein Aldehyd.
Dies ist eine ungesättigte Aminobindung.
Sie alle binden kovalent an das n-terminale Threonin.
Epoxomicin bindet kovalent an das Threonin-Hydroxyl und an den Amino-Terminus.
Diese Strukturen zeigten dann unvorhergesehene Variationen der Bindungsstelle und ebenso Überraschungen hinsichtlich der Chemie.
Ich glaube nicht, dass Sie das sehen können, aber dieses Salinosporamid ist eine Variante dieses einfacheren Omuralids.
Ein Beta-Lakton – es acyliert selbstverständlich das n-terminale Threonin, aber hier ist eine Chlorethylen-Gruppe.
Wenn nun, nach der Acylierung, die Hydroxyl-Gruppe des Laktons verfügbar wird,
reagiert sie damit und verschmilzt und bildet einen Tetrahydrofuran-Ring, wodurch die Interaktion absolut irreversibel wird.
Dies ist eine andere Entdeckung,
die wir zufällig machten: Ein zugelassener Lipoxygenase-Inhibitor ist tatsächlich ein sehr starker Inhibitor für das Proteasom,
nicht-kovalent, aber er eröffnet neue Wege für die weitere Entwicklung.
Das sind die entdeckten Proteasom-Inhibitoren, zu Gruppen zusammengefasst ...
einige von ihnen sind entsprechend ihrer Chemie zu Gruppen zusammengefasst.
Hier finden Sie Aldehyde, Beta-Laktone, Boronsäuren, Non-Peptide, zyklische Peptide und so weiter
Nur ein Beispiel für die Entdeckung einer neuen chemischen Substanz,
die wir vor einigen Jahren in Zusammenarbeit mit Pflanzen-Biologen machten:
Sie hatten herausgefunden, dass dieser Krankheitserreger einer Bohnenpflanze einen Virulenzfaktor benötigt.
Und dieser Virulenzfaktor sondert ab ... hat diese Formel.
Es handelt sich also um eine ungesättigte Aminobindung.
Wir stellten fest, dass sie kovalent an das Proteasom bindet, eine Michael-Addition.
In vivo zeigt sich, dass sich in diesen Bohnenpflanzen-Zellen Cyclin B1, polyubiquitiniert, anreichert.
Folglich arbeitet das Proteasom, das Pflanzen-Proteasom, nicht mehr.
Und infolgedessen kommt es zur Apoptose der Zellen.
Das ist natürlich ... war eine neue chemische Substanz und wurde wiederum von Chemikern synthetisiert
und auf verschiedene Weisen modifiziert.
Eine andere – ich sehe, dass die Zeit voranschreitet – ist das konstitutive Proteasom,
welches bis jetzt das Target für die meisten oder alle Aktivitäten war,
aber es weist eine sehr schwerwiegende Pathogenität auf, eine Neuropathogenität.
In Immunzellen wird eine Variante des Proteasoms gebildet, die als Immunproteasom bezeichnet wird
und sehr große Ähnlichkeit besitzt: Es hat alle 28 Untereinheiten und sie sind identisch,
mit Ausnahme der 2 mal 3 Untereinheiten, die für die katalytische Aktivität verantwortlich sind.
Es verändert sich also.
Die Spezifität ist ein bisschen verändert, und das Immunproteasom bildet mehr MHC-Klasse 1-Liganden-Moleküle.
Von Interesse ist dabei, dass wir nun, indem wir nur auf das Immunproteasom als Target abzielen,
die Toxizität der Inhibitoren der konstitutiven Proteasome umgehen können.
Das eröffnet eine neue Strategie gegen Autoimmunerkrankungen, denn wir blockieren gezielt das Immunsystem.
Das hier werde ich überspringen – ich sehe, dass die Zeit davonläuft –
und ein paar Worte zu dem neuartigen Aktivierungs- und Inhibitionsmechanismus sagen, den wir bei DegS sahen.
Dort geschieht eine Aktivierung durch das Substrat selbst und es kommt zu einer Oligomerisierung – das war ein neues Prinzip.
HtrA/DegS bilden eine große Familie, die überall vorzufinden ist.
Alle Mitglieder bestehen aus einer Protease-Domäne, die Trypsin ähnlich ist, und PDC-Domänen.
Diese sind Modelle für die Protein-Protein-Interaktion.
DegS spielen eine Rolle bei allen Organismen und bei allen Zelltypen – dies ist ein Beispiel eines Pflanzen-Chloroplasten –,
denn die DegS sind für den Abbau des D1-Proteins verantwortlich.
Was sind D1 und D2? D1 und D2 sind die zentralen Bestandteile des Fotosystems II.
Dort werden die Chlorophylle gebunden, dort findet die Reaktion statt.
Das sind D1, D2. Dies ist das Fotosystem II, vor kurzem analysiert.
Das ist unser bakterielles Reaktionszentrum.
Der Kern des Partikels ist identisch bei Bakterien und Pflanzen.
Pflanzen haben viele zusätzliche regulierende Proteine.
Aber hier passiert es, der erste Schritt der Fotosynthese; hier werden die Chlorophylle gebunden.
Und die aufregende Entdeckung vor vielen Jahren war,
dass von diesen beiden nahezu symmetrischen L- und M- bzw. D1- und D2-Untereinheiten
mit ihrem gebundenen Chlorophyll nur die L-Untereinheit katalytisch aktiv ist;
der Elektronen-Transfer ereignet sich nur in L bzw. D1.
Daher ist es nicht verwunderlich, dass D1 besonders anfällig für Stress ist,
denn Elektronen-Transfer in organischem Material erzeugt Radikale.
Die DegS kümmern sich darum, sie erkennen ungefaltetes D1 und entfernen es.
Aber es ist immer noch erstaunlich, dass dieser wesentliche Bestandteil einer Pflanze,
nämlich ihr Fotosystem, einen Durchsatz von weniger als einer Stunde hat.
Hier haben wir nun Zellen von Säugetieren und Bakterienzellen.
Die DegS spielen eine Rolle bei der Stimulierung der Stress-Gene – keine Zeit, darüber zu sprechen.
Aber der einfachere Mechanismus, den wir dort entdeckten, ist der des DegP-Hexamers,
der den periplasmatischen Raum nach ungefalteten Proteinen durchsucht,
insbesondere nach ungefalteten Proteinen der äußeren Membran.
Wie sieht es aus?
Die erste Struktur bestimmten wir vor einigen Jahren, die Apo-Struktur – die inaktiv ist, und warum dies so ist,
werde ich Ihnen in einer Minute zeigen – in zwei Formen, die bereits zeigen,
dass es sich um eine höchst flexible Anordnung handelt.
Wir fanden zwei Formen: eine offene Form und eine geschlossene Form.
Der zentrale Kern, welcher der Trypsin-ähnliche Kern ist, der den Trimer bildet, ist unverändert,
aber die PDC-Domänen sind beweglich und können entweder eine geschlossene oder eine offene Struktur bilden.
Das wesentliche Experiment bestand in einer großen Reihe von Experimenten und ist hier dargestellt.
Ich möchte jedoch nur auf ein einziges hinweisen, das die Analyse in Gang brachte: das war die Gel-Chromatografie.
Man inkubierte DegP-Hexamer mit Kasein, das ein gutes Substrat ist, und schaute sich dann das Gel-Chromatogramm,
die Abstände im Chromatogramm nach einer Minute an – das war der Trick:
Wer nimmt schon eine Chromatografie nach nur einer Minute Inkubation vor?
Aber dies zeigte den Schlüssel für alles Folgende auf.
Nach einer Minute sehen Sie Kasein, aber Sie sehen nicht das hexamerische DegP,
sondern stattdessen einen 24-mer.
Und das setzte, wie ich sagte, diese ganze Reihe von Experimenten in Gang, um herauszufinden,
um was es sich handelt.
Wir konnten den 24-mer isolieren, der einen wunderschönen Käfig bildet – stellen Sie sich einen Kubus vor,
in jedem der acht Eckpunkte des Kubus sitzt ein Trimer von Trypsinen, und die PDC-Domänen füllen dann den Rest aus.
Es ist also ein großer Käfig, in Hinblick auf die Ausmaße vergleichbar mit oder sogar größer als GroEL.
Diesen Vergleich habe ich mit einer ganz bestimmten Absicht angestellt.
Denn es stellte sich heraus, dass diese Oligomere von DegP nicht nur Proteasen, sondern auch Chaperone sind.
Sie bilden außerdem nicht nur 24-mere, sondern auch 12-mere.
Ich komme zum Schluss.
Warum Elektronenmikroskopie, die wir bezüglich der Atome interpretieren können?
Weil wir die exakten Kristallstrukturen der Bestandteile haben.
Wir sehen ein Lysosom, das hier drinnen bindet.
Was ist der Auslöser?
Der Auslöser ist der C-Terminus des Omp, der bei einem gesunden Protein nicht zur Verfügung steht.
Wenn er jedoch herausragt, ist dies ein Zeichen für eine Erkrankung dieses Proteins,
es ist nicht funktionsfähig, und das löst das DegP aus;
die Oligomerisierung und die Strukturänderung in dem Molekül aktivieren es.
Das ist eine Zusammenfassung dieses letzten Teils.
Sie haben ein ungefaltetes Omp.
Sie haben das inaktive hexamerische DegP, aber das ungefaltete Omp zeigt ein Signal.
Es zeigt seinen freiliegenden C-Terminus, was dann die Oligomerisierung bewirkt.
Es formt also eine Hülle um sein Target.
Was passiert nun? Hat es eine Chance?
Wir wissen, dass die DegS eine Chaperon-Funktion haben – offensichtlich haben sie eine Chance.
Sie haben eine Chance, wenn es ihnen im Inneren dieses Käfigs gelingt,
ihren freiliegenden C-Terminus in ihren eigenen Körper zu integrieren.
Die Entscheidung zwischen Leben und Tod des Proteins wird also irgendwo getroffen.
Wahrscheinlich ist der entscheidende Faktor das Ausmaß des Schadens.
Wenn es sehr stark beschädigt ist, kann es sich nicht neu falten, und dann wird es abgebaut.
Das ist München. Ich erwähnte das Deutsche Museum, wo Röntgens und von Laues Maschinen ausgestellt sind.
Und dies ist die Münchener Universität; dort arbeitete von Laue und begann mit der Kristallografie,
gab der Chemie und dann der Biologie ein Gesicht.
Ich danke Ihnen.
Applaus.
