Es ist mir eine große Freude zu so vielen jungen Forschern zu sprechen.
Richard Ernst hat Ihnen ja gerade mitgeteilt, was wichtig ist, um einen Job zu bekommen,
dass Sie mindestens 4-dimensionales Wissen brauchen oder auch mehr.
Er hat Ihnen auch mitgeteilt, was wichtig ist, um glücklich zu sein.
Ich sage Ihnen jetzt, was wirklich wichtig ist.
Und das ist natürlich zu verstehen, was in unserem Gehirn vor sich geht.
Seit etwa 100 Jahren wissen wir dank der Arbeit des berühmten spanischen Neuroanatoms Ramon y Cajal
und dank der Arbeit weiterer Neuroanatome dieser Zeit, dass unser Gehirn ein Netzwerk ist,
ein sehr komplexes Netzwerk aus Milliarden von Zellen, die hier abgebildet sind.
Dies ist eine von Cajal gezeichnete Darstellung von nur ein paar Zellen aus dem Kortex.
Heute wissen wir natürlich weit mehr über die Signalübertragung in diesem Netzwerk von Zellen.
Und insbesondere über die Vorgänge in diesen Zellen.
Wir haben herausgefunden, dass ein Neuron, wie die meisten anderen Zellen auch, über die wesentlichen Bestandteile verfügt,
die eine Zelle braucht, nämlich den Zellkörper, einige Organellen, Mitochondrien usw.
Das Besondere an einem Neuron aber sind seine Extensionen.
Eine dieser Extensionen, das Axon, das Sie hier sehen,
oder wenn Sie dieses Neuron nehmen, wie Sie hier sehen, diese lange, röhrenartige Struktur,
entlang derer sich ein Aktionspotenzial, ein Nervenimpuls ausbreitet.
Und man kann außerdem sehen, dass das Neuron noch eine andere Art von Extension aufweist,
nämlich die Dendriten mit diesen knubbeligen Strukturen daran.
Und genau dort stellen die Nervenenden Kontakt her, wie hier.
Oder nehmen wir noch einmal dieses Neuron, dieses Nervenende stellt Kontakt her mit diesem Neuron an der sogenannten Synapse.
Die Synapsen sind also die Kontaktpunkte zwischen den Neuronen.
Und was ein einzelnes Neuron tut, ist, es akkumuliert, es integriert die Informationen, die an all diesen Synapsen,
die mit seinen Dendriten in Kontakt stehen, hereinkommen.
Es integriert sie und jedes Mal, wenn ein Aktivitätsschwellenwert überschritten wird,
wird ein neues Aktionspotenzial erzeugt und entlang des Axons weitergeleitet, um dann eine andere Zelle zu erregen.
Und es ist die enorme elektrische Aktivität, die in diesem Netzwerk fließt,
die diese Aufgabe der Informationsverarbeitung bewältigt.
Und in den letzten 30, 40 Jahren haben Neurowissenschaftler herausgefunden,
dass es die sogenannte synaptische Plastizität ist, die die Grundlage der Informationsverarbeitung im Gehirn bildet.
Im Gegensatz zum Computer, bei dem die Verbindungen zwischen den Elementen in ihrer Stärke festgelegt sind,
ist die synaptische Stärke, also das in dieser Zelle
durch das Aktionspotenzial der vorgelagerten Zelle vermittelte Signal nicht festgelegt,
es ist plastisch, in dem Sinne, dass es sich fortwährend ändert, während Informationen durch das System fließen.
Also kurz, was an der Synapse geschieht, wenn ein Aktionspotenzial in das Nervenende eindringt,
es findet ein aus 4 Schritten bestehender Prozess statt.
Das Aktionspotenzial öffnet Kalziumkanäle, eine besondere Art von Ionenkanälen, die Kalziumionen in das Zytosol einströmen lassen.
Der Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration, hier durch diese Punktwolke dargestellt, löst Exozytose aus,
das heißt, er löst aus bzw. er bringt einige der Speichergranula wie diese hier,
die Neurotransmitter enthalten, dazu, mit der Plasmamembran zu verschmelzen und ihren Inhalt freizusetzen.
Der Neurotransmitter diffundiert durch den synaptischen Spalt und auf der anderen Seite öffnet ein Neurotransmitter Ionenkanäle,
sodass Ionenströme in die postsynaptische Membran fließen und erneut ein elektrisches Signal erzeugen können.
Was hier also vorliegt, ist die Umwandlung eines elektrischen Signals in ein chemisches und zurück in ein elektrisches Signal.
Was also genau ist synaptische Plastizität?
Ich habe bereits gesagt, dass der Begriff den Effekt beschreibt,
dass sich die in einer solchen Synapse transformierte Signalstärke fortwährend ändert.
Und, wie ich schon sagte, glaubten Neurowissenschaftler, dass es diese fortwährende Neuverdrahtung ist,
diese permanente Änderung der Netzwerkeigenschaften,
die einigen der komplexeren Informationsverarbeitungsaufgaben des Zentralnervensystems zugrunde liegt.
Diese Plastizität findet auf verschiedenen Zeitskalen statt, auf sehr kurzen Zeitskalen, auf langen Zeitskalen,
in dem Sinne, dass bei mehrmaliger Stimulierung einer Synapse diese ihre Stärke ändert.
Hält der Stimulus nur kurz an, ist diese Änderung leicht rückgängig zu machen.
Wenn Sie eine bestimmte Art von Signal jedoch immer wieder anwenden, ist die dadurch induzierte Änderung nachhaltiger.
Und dabei ist ein wichtiger Punkt, auf den ich in einer späteren Folie zurückkommen werde,
dass die Natur alle möglichen, ihr zur Verfügung stehenden molekularen Mechanismen,
die sich im Laufe der Evolution entwickelt haben, nutzt,
um diese fein abgestimmte Regulierung der synaptischen Übertragung zu erreichen.
Wenn wir heute in den Labors die synaptische Übertragung untersuchen,
möchten wir natürlich nicht nur den Mechanismus an sich verstehen, sondern auch,
und das ist die Art von Problemen, mit der wir uns in unserem Labor beschäftigen,
welche Mechanismen diesen plastischen Änderungen zugrunde liegen.
Was also meine ich mit Plastizität, insbesondere mit den kurzzeitigen plastischen Änderungen,
die wir in unserem Labor untersuchen?
Dies zeigt mehr oder weniger einen Überblick über einige der verschiedenen Formen von Kurzzeitplastizität,
die Sie in verschiedenen Synapsen im Gehirn beobachten können.
Hier oben in diesem Fall zum Beispiel, wird eine bestimmte Art von Synapse zehnmal stimuliert,
der erste Stimulus bewirkt eine heftige Antwort.
Die nachfolgenden Antworten werden schwächer und schwächer.
Wenn Sie die Antwortamplitude gegenüber der Zeit darstellen, sehen Sie eine absteigende Funktion.
Diese Art der Plastizität nennt man Kurzzeitdepression.
Eine andere Synapse, die gleiche Struktur im Gehirn, gibt genau die gegenteilige, eine stark fördernde Antwort.
Eine dritte Art von Synapse gibt eine Kombination aus beiden, Bahnung gefolgt von Depression.
So hat also jede Art von Synapse, die wir morphologisch unterscheiden können,
auch einen eigenen Charakter in Bezug auf die Kurzzeitplastizität.
Bevor wir ins Detail der Mechanismen gehen, lassen Sie mich auf einen allgemeineren Gesichtspunkt kommen.
Wir wissen, dass in primitiven Organismen, und ich hätte hier als Beispiel auch Hefe zeigen können,
einfache Organismen, innerhalb einfacher Zellen gibt es eine ungeheuer komplizierte Signalkaskade.
Und diese regulierenden Netzwerke zur Regulierung des Stoffwechsels,
zur Regulierung des Zellzyklus, zur Regulierung der Proteinbiosynthese usw.
haben sich natürlich im Laufe der Evolution entwickelt.
Und die Evolution brauchte etwa 80 % der verfügbaren Zeit, um diese sehr komplizierten Netzwerke,
die sich im Wesentlichen in jeder Zelle befinden, zu entwickeln.
Nun tendiert die Evolution dazu, frühere Erfindungen für neue Zwecke wiederzuverwenden.
Chemische Übertragung ist eine relativ neue Erfindung der Evolution.
Ich meine, chemische Übertragung erlangte natürlich erst Bedeutung,
als es vielzellige Organismen gab und nachdem sich ein umfangreicheres Nervensystem entwickelt hatte.
Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass die Evolution all diese Mechanismen wiederverwendete, um die Aufgabe zu erfüllen.
Und tatsächlich, wahrscheinlich lag der Grund dafür,
dass die Natur zur Übertragung eines Signals von einem Neuron auf ein anderes zu so komplizierten Maßnahmen gegriffen hat,
lag der wahrscheinlichste Grund darin, dass die Möglichkeit bestand, frühere Erfindungen wiederzuverwenden.
Damit will ich sagen, es gab eine lange Diskussion in den Neurowissenschaften darüber,
warum es so viel chemische Übertragung im Gegensatz zu elektrischer Übertragung gibt.
Elektrische Übertragung gibt es im Nervensystem auch, in dem es einfach elektrische Verbindungen zwischen zwei Zellen gibt,
um ein elektrisches Signal von einer Zelle zur nächsten weiterzuleiten.
Die Mehrheit der Synapsen jedoch, insbesondere die an der Signalverarbeitung beteiligten,
verwenden diesen sehr komplizierten Vorgang der chemischen Übertragung, um die Erfindungen der Evolution wiederzuverwenden.
Aus diesem Grund, und jetzt komme ich zu meiner Überschrift zurück, ist es nicht überraschend, Kalzium,
einen der wichtigsten sekundären Botenstoffe, und auch zyklisches AMP unter den Regulatoren zu finden.
Mit meiner Überschrift wollte ich nicht sagen,
dass zyklisches AMP und Kalzium in irgendeiner Weise etwas Besonderes sind, sie sind lediglich Beispiele.
Wahrscheinlich hätte ich ein beliebiges anderes Beispiel eines wichtigen Signalwegs aus der normalen Zellbiologie nehmen können
und hätte herausgefunden, dass dieses den einen oder anderen Schritt in der synaptischen Übertragung beeinflusst.
Aus Zeitmangel werde ich mich daher in diesem Vortrag wahrscheinlich nur auf Kalzium konzentrieren,
Ihnen ein Beispiel für die Bedeutung von Kalzium im echten Auslösemechanismus geben,
und dann am Ende nur erwähnen, an welchen Stellen zyklisches AMP ins Spiel kommt.
Wenn wir also über synaptische Kurzzeitplastizität reden, über die Tatsache, dass sich die synaptische Übertragung ändert,
wenn diese Synapse wiederholt verwendet wird, dann möchten Sie natürlich fragen, was sich eigentlich ändert.
Ich erkläre Ihnen jetzt den grundlegenden Mechanismus der synaptischen Übertragung,
die Freisetzung von Neurotransmitter, das Öffnen der Kanäle auf der anderen Seite.
Was ich bisher nicht erwähnt habe, ist natürlich der Umstand, dass ein verbrauchtes Vesikel,
eines, das seinen Inhalt verloren hat, neu gebildet werden muss,
die Membran, die jetzt Teil der Zellmembran geworden ist, muss wiederhergestellt werden.
Neue Vesikel müssen gebildet, diese müssen mit Transmitter gefüllt werden.
Sie müssen an die richtigen Stellen transportiert werden usw.
Innerhalb dieses aus vielen Schritten bestehenden Vorgangs, kann es Veränderungen geben,
und in der Tat gibt es Veränderungen, während diese Kurzzeitplastizität stattfindet.
Aus mechanistischem Blickwinkel betrachtet können diese Veränderungen auf Ebene der sekundären Botenstoffe auftreten,
es können Veränderungen in der Phosphorylierung der beteiligten Proteine sein.
Es gibt längerfristig betrachtet eine Proteinsynthese, Proteinabbau,
es gibt Umstrukturierungen des Zytoskeletts, die hier eine Rolle spielen.
Und natürlich gibt es grobe morphologische Veränderungen wie die Aussprossung eines Axons und die Bildung ganz neuer Synapsen.
Lassen Sie mich jetzt zu dem kommen, was wir in unserem Labor machen.
Wie ich bereits sagte, sind die meisten Prozesse, die wir untersuchen, einfach Prozesse, die man aus anderen Zusammenhängen kennt.
Synaptische Plastizität wurde bereits in den 1950er-Jahren beschrieben.
Dennoch gestaltete es sich aus zwei Gründen schwierig, Fortschritte beim Verständnis dessen zu erzielen, was geschieht.
Zuerst einmal ist es bei diesem aus mehreren Schritten bestehenden Prozess, bei dem Sie nur messen können...
Sie stimulieren einen Nerv und Sie messen die Ausgabe, das Ergebnis, das Signal in der postsynaptischen Zelle.
Daher ist es schwierig, eine bestimmte Veränderung einem bestimmten Mechanismus zuzuordnen.
Und besonders schwierig ist es auch deshalb,
weil präsynaptische Endigungen von Natur aus sehr kleine Strukturen mit einem Durchmesser von nur 1 oder 2 Mikrometer sind,
die mit elektrophysiologischen Mitteln nicht leicht zugänglich sind.
Dennoch wusste man seit der Arbeit von Cajal oder sogar schon davor,
dass es an manchen Stellen in unserem Gehirn besondere Synapsen mit sehr großen Endigungen gibt.
Dies ist eine Zeichnung, wieder von Cajal, der diese Art von Held'schen Calyces sehr häufig zeichnete,
weil er sie mochte, er hielt sie für einen Beweis seines Konzepts des Neurons,
das zu seiner Zeit vor 100 Jahren eine große Kontroverse darstellte,
ob es denn nun Neuronen im Gehirn gäbe oder einzelne Einheiten oder ob das Gehirn ein Synthesium wäre.
Und er verwendete die Held'sche Calyx gerne als Waffe gegen die sogenannten Antineuronistas.
Was also ist die Held'sche Calyx?
Das ist eine Synapse in der zentralen Hörbahn.
Was Sie hier sehen ist ein Gehirnschnitt, sozusagen eine Scheibe vom Hirnstamm einer Ratte,
bei dem Sie den Signalweg eines akustischen Signals erkennen können.
Ein Geräusch erzeugt also Aktionspotenziale im Ohr, in der Cochlea, die an diesen Teil des Gehirns übertragen werden,
übertragen durch eine Synapse hier im ventralen Cochleariskern.
Und dann überschreiten die Information und das Aktionspotenzial die Mittellinie
und bilden eine Synapse zu einer anderen Zelle hier.
Und der Ausgang dieser Synapse geht dann wiederum zu einem anderen Bereich im Gehirn, der sogenannten lateralen oberen Olive.
Und hier in der lateralen oberen Olive trifft die Information von einem Ohr zuerst auf die Information vom anderen Ohr.
Nun haben wir beim Hören eine sehr komplizierte Aufgabe zu erfüllen, nämlich die Lokalisation des Geräuschs, Richtungshören,
damit wir mit etwa 5° Präzision erkennen können, woher das Geräusch kommt,
müssen wir die Zeitunterschiede zwischen diesen Informationen mit einer Genauigkeit von etwa 20 bis 50 Mikrosekunden erkennen.
Auch müssen wir in der Lage sein, Intensitätsunterschiede sehr genau zu erkennen.
Und aus diesem Grund, weil Information so präzise weitergeleitet werden muss,
sind diese zwei Synapsen auf ganz bestimmte Weise gebaut, mit sehr großen präsynaptischen Endigungen, wie hier gezeigt.
Eine präsynaptische Endigung, die ein kompaktes postsynaptisches Neuron wie ein Kelch, eine Calyx, umgibt,
deshalb heißt diese Held'sche Calyx.
Und in dieser sehr großen Synapse gibt es etwa 500 sogenannte aktive Zonen,
Regionen,in denen Sie Ansammlungen von Vesikeln erkennen, in denen Vesikel freigesetzt werden und auf ein postsynaptisches Ziel treffen.
Und diese große Struktur hier erlaubt es uns, Elektroden in beide Kompartimente einzuführen
und die elektrischen Signale beider Kompartimente gleichzeitig zu messen.
Wir können die sogenannte Voltage-Clamp-Technik anwenden, die es uns ermöglicht, die Spannung festzulegen,
die elektrischen Signale hier auf beiden Seiten.
Und sie ermöglicht es uns ebenfalls, mithilfe von Pipetten Substanzen in diese beiden Kompartimente einzuschleusen.
Und das verwenden wir, um diese Kompartimente mit Fluoreszenzfarbstoffen zu füllen, wie hier.
Diese Pipette hier enthält den Fluoreszenzfarbstoff, der in die Calyx diffundiert ist,
und daher sehen Sie hier in der Fluoreszenzmikroskopie den Farbstoff, der sich hier verteilt hat.
Auch den Farbstoff, der ins Axon diffundiert ist.
Und wir verwenden diese Fluoreszenzfarbstoffe, zum Beispiel Kalziumindikatorfarben, um Kalzium zu messen,
und wir verwenden dies auch, wie ich in einer Minute zeigen werde, um caged-Verbindungen einzufüllen.
Nun, die Synapse zeigt synaptische Plastizität, wie ich Ihnen zuvor erläutert habe,
bei einer bestimmten Konzentration an extrazellulärem Kalzium, Sie sehen hier die typische Reihenfolge von Bahnung und Depression,
wenn Sie die Synapse mit einer 100-Hz-Impulsfolge stimulieren.
Und wie ich bereits gesagt habe, möchten wir herausfinden,
was die Grundlage dieser kurzzeitigen Formen synaptischer Plastizität ist.
Kurz gesagt, die erwähnte Bahnung wird gewöhnlich als Aufbau des lokalen Kalziumsignals verstanden.
Wenn sich die Kalziumkanäle öffnen, erzeugen sie sogenannte Mikrodomänen erhöhter Kalziumkonzentration.
Die rote Farbe hier soll die Kalziumkonzentration anzeigen, die in diese Kanäle einströmt.
Aber, wie diese Abbildung anzeigt, sind die Domänen erhöhter Kalziumkonzentration sehr klein,
wenn sich die Kanäle nur kurz öffnen.
Wenn Sie eine Zelle jedoch wiederholt stimulieren, wenn sich diese Kanäle wiederholt öffnen und schließen,
sammelt sich das Kalzium an und erreicht nach drei oder vier Aktionspotenzialen schließlich größere Ausmaße,
erhöht sich einfach sukzessive.
Auf der anderen Seite versteht man die sich anschließende Depression gewöhnlich als Erschöpfung der verfügbaren Vesikel,
in dem Sinne, dass, wenn Sie Synapse 1 stimulieren,
ein relativ großer Teil der sich hier befindenden einsatzbereiten Vesikel aufgebraucht wird,
sodass erst neue Vesikel zur Membran gebracht werden müssen, Vesikel neu erzeugt werden müssen.
Und dies schließlich ist der limitierende Faktor in der Synapse, der dazu führt, dass das Signal abnimmt,
wenn Sie mit der Stimulierung fortfahren.
Wie schon gesagt, konzentriere ich mich auf nur einen Aspekt dieser ganzen Sache,
nämlich auf die Rolle des lokalen Kalziumanstiegs, um diesen Vorgang der Fusion eines Vesikels mit der Plasmamembran auszulösen.
Wir wissen bereits seit 50 Jahren, seit der Arbeit von Katz und Miledi und später auch von Eccles,
dass ein Anstieg dieses Kalziums sofortiger Auslöser des Geschehens hier ist.
Aber aufgrund dieser komplizierten geometrischen Anordnung wussten wir nicht,
wie stark die Kalziumkonzentration an der Stelle der Kalziumwahrnehmung ansteigen muss,
wir wissen aus bildgebenden Kalziumuntersuchungen, dass der Anstieg an freiem Kalzium räumlich sehr begrenzt ist.
Aber natürlich können Kalziumuntersuchungen mit bildgebenden Verfahren keine Auflösung erreichen,
die kleiner als die Wellenlänge des Lichts ist, ein paar Hundert Nanometer.
Und die Abstände zwischen den Kanälen und dem Rest sind kleiner als ein paar Hundert Nanometer.
Und abhängig davon, wie nah ein Kanal der freisetzenden Seite ist,
lassen sich Kalziumkonzentrationen im Bereich von 10 Mikromolar bis zu beinahe einem Millimolar messen.
Daher unternahmen wir jetzt den ernsthaften Versuch, wirklich herauszufinden,
welche Empfindlichkeit der Freisetzungsapparat aufweist.
Und wie schon gesagt ist dies kompliziert, weil wir die exakten Abstände nicht kennen,
und daher auch aus der Messung von Kalzium nicht schließen können, was lokal wirklich geschieht.
Hilfe kommt aus der Chemie.
Wir können nämlich auf das Innere sogenannte caged-Verbindungen, caged-Kalzium, Substanzen wie EGTA, Kalzium-Chelatoren anwenden,
die jedoch photolabil sind.
Der Kalzium-DM-Nitrophen-Komplex ist eine dieser Substanzen, die Sie durch Blitze mit UV-Licht zerstören können,
um Photoprodukte zu erzeugen und das daran gebundene Kalzium freizusetzen.
Wir können dies einfach in den Gesundheitseinrichtungen tun, indem wir diese caged-Verbindung, zusammen mit der Indikatorfarbe,
in die präsynaptische Endigung einschleusen.
So können wir hier die Konzentration an freiem Kalzium durch Fluoreszenz messen.
Und wir können durch einen UV-Lichtblitz einen sprunghaften Anstieg der Konzentration an freiem Kalzium bewirken.
Und das ist hier auf dieser Hälfte dargestellt.
Hier erkennen Sie, dass wir im ersten Experiment nur einen schwachen Blitz ausgelöst haben,
der die Kalziumkonzentration auf etwa 2 Mikromolar ansteigen ließ, und Sie erkennen, dass dies in der postsynaptischen Zelle,
in dieser Pipette, ein sehr schwaches und verrauschtes Stromsignal hervorrief.
Es ist sehr schwach und verrauscht, weil es durch die Freisetzung nur relativ weniger Vesikel entsteht.
Wir wissen, wir können messen, dass ein einzelnes, Transmitter enthaltendes Vesikel,
wenn es den Transmitter freisetzt, nur ein schwaches Signal erzeugt.
Ein sogenannter Miniaturstrom erregt einen postsynaptischen Strom
in der Größenordnung von 20, 30 Picoampere, der sehr rasch abfällt.
Und was Sie hier sehen, ist tatsächlich die Überlagerung einer ganzen Reihe solcher Ereignisse,
aber immer noch mit einer relativ niedrigen Rate von vielleicht ein paar Ereignissen pro Millisekunde.
Nun, wenn wir einen stärkeren Blitz auslösen und Kalzium auf 4 Mikromolar ansteigen lassen,
erkennen Sie, dass wir einen weit stärkeren Strom induzieren, das ist jetzt eine andere Skala.
Es ist immer noch ein bisschen verrauscht,
weil es natürlich auch aus der Überlagerung vieler dieser elementaren Ereignisse besteht.
Wenn Sie auf 6 Mikromolar gehen, induzieren Sie einen Strom von etwa 7-8 Nanoampere, was vergleichbar ist mit dem Strom,
den Sie durch Stimulation der Synapse auf die herkömmliche physiologische Weise, durch ein Aktionspotenzial, induzieren.
Eine erste Antwort auf unsere Frage, wie hoch muss die Kalziumkonzentration ansteigen,
um eine normale physiologische Antwort zu erzeugen, lautet daher, sie muss in den Bereich von 6 Mikromolar ansteigen.
Das ist natürlich keine exakte Antwort, denn was wir hier machen ist, wir erhöhen das Kalzium und das Kalzium bleibt erhöht.
In Wirklichkeit öffnen sich die Kalziumkanäle bei Eintreffen eines Aktionspotenzials dagegen sehr kurzzeitig
und schließen sich wieder, sodass es nur zu einem sehr kurzlebigen, vorübergehenden Kalziumanstieg kommt
und man erwarten würde, dass höhere Kalziumkonzentrationsspitzen erforderlich wären, um hier dieselbe Antwort zu erzeugen wie in dem Fall,
in dem die Kalziumkonzentration erhöht bleibt.
Daher müssen wir weitere biophysikalische Analysen vornehmen und die Art von Analyse, die wir hier vornehmen,
ist nicht Spektroskopie sondern Entfaltungsanalyse.
Entfaltungsanalyse ist wie die Spektroskopie eine lineare Technik, bei der angenommen wird,
dass die hier gemessene Antwort die lineare Überlagerung von Signalen dieser Form ist.
Wenn Sie das elementare Signal kennen, können Sie diese Spuren entfalten und erhalten als Ergebnis eine Zeitfunktion,
der Sie die Wichtung entnehmen können, mit der diese einzelnen Signale auftreten und zur Entstehung dieser Spuren beitragen.
Wie Sie hier sehen können, ist die Antwort bei Entfaltung dieser Spur hier,
dass die Wichtung der Ausschüttung sehr kurz nach dem Blitz
auf einen Wert von vielleicht ca. 10 Ereignissen pro Millisekunde ansteigt und dann wieder abfällt.
Bei einem stärkeren Blitz, die schwarze Kurve hier, erkennen wir,
dass die Rate schnell auf einen Spitzenwert von etwa 60 Freisetzungsereignissen pro Millisekunde ansteigt.
Sie fällt dann rasch ab, trotz der Tatsache, dass die Kalziumkonzentration immer noch hoch ist.
Daher muss das bedeuten, dass wir den Vorrat an sekretionsbereiten Vesikeln erschöpft haben.
Und tatsächlich ergäbe sich aus der Konstante für die Abfallzeit die Zeit,
die es bei einem bestimmten Vesikel durchschnittlich dauert,
bis die Freisetzung bei einer Kalziumkonzentration dieser Amplitude erfolgt.
Wir können also viele dieser Experimente durchführen, die maximalen Ausschüttungsraten analysieren,
halbe Anstiegszeiten analysieren usw., eine kinetische Analyse davon durchführen.
Und wir erkennen, wenn wir zum Beispiel die maximale Ausschüttungsrate
dem während des Experiments erreichten Kalziumwert gegenüberstellen, dass dies eine sehr steile Kalziumfunktion ergibt.
Diese gebrochene Kurve hier hat einen Anstieg von 4,2.
Das bedeutet, dass Sie vermutlich mindestens 4, wenn nicht 5 Kalziumionen brauchen, um den Vorgang auszulösen.
Wir erkennen, dass sich die Verzögerung mit dem Anstieg von Kalzium verkürzt.
Und wir können mithilfe dieser Daten ein biophysikalisches Modell entwickeln, bei dem wir annehmen,
dass ein Kalziumsensor X Kalzium binden muss, und nachdem er 5 Kalziumionen gebunden hat, kann er verschmelzen.
Die kinetischen Daten erlauben es uns dann, die Ratenkonstanten, die Rate der Kalziumbindungen, die Rate der Kalziumzuordnung,
die Fusionsrate des fünffach gebundenen Sensors zu ermitteln.
Und nachdem wir auf diese Art die Kinetik des Systems im Wesentlichen charakterisiert haben,
können wir uns jetzt wieder der Frage zuwenden, was während eines Aktionspotenzials geschieht,
wenn wir jetzt einfach nur postsynaptisch aufzeichnen, den afferenten Nerv stimulieren,
ein Aktionspotenzial im afferenten Nerv erregen und einen postsynaptischen Strom dieser Form beobachten.
Wir können den postsynaptischen Strom entfalten und erhalten diese Zeitfunktion, die die Ausschüttungsrate darstellt,
Vesikel pro Millisekunde, die während des Aktionspotenzials freigesetzt werden.
Wir können erkennen, dass die maximale Ausschüttungsrate bei etwa 300 Vesikeln pro Millisekunde liegt,
dass die Ausschüttung während eines sehr kurzen Intervalls vor sich geht,
mit einer Halbwertsbreite von nur etwa einer halben Millisekunde.
Jetzt können wir zu unserem biophysikalischen Modell zurückgehen und fragen,
mit welcher Kalziumkonzentration müssen wir das Modell füttern, um diese schwarze Kurve hier zu erhalten.
Die Antwort ist, dass wir auf das Modell eine Kalzium-Zeitfunktion anwenden müssen.
Wie diese rote Funktion, die rote Spur hier.
Und sie sagt uns, dass wir sozusagen eingreifen, dass wir eine maximale Kalziumkonzentration von etwa 25 Mikromolar brauchen.
Dass wir eine Kalzium-Zeitkurve dieses Kalziumsignals mit nur ungefähr 400 Mikrosekunden Halbwertsbreite brauchen.
Wenn wir das Modell mit einem breiteren Kalziumsignal füttern, wird das Ergebnis zu breit ausfallen,
die Anstiegszeit des EPSP wäre zu lang.
Daraus schließen wir, dass der Kalziumtransient sehr kurz sein muss, mit einem Peak von etwa 20 Mikromolar,
mit einer Halbwertsbreite von nur einer halben Millisekunde.
Nun, neuere Messungen von einem Studenten im Labor von Bert Sakmann haben gezeigt, dass man,
wenn man experimentell durch Modifizierung der caged-Kalzium-Technik solch kurze Kalziumtransienten induziert,
tatsächlich genau diese Wellenformen anwenden muss, die von diesem Modell vorausgesagt wurden,
um aktionspotenzialähnliche Antworten zu erzeugen.
Und biophysikalische Modelle sagen Ihnen weiterhin,
dass solch hohe Kalziumkonzentrationen nur in den Mikrodomänen um offene Kanäle herum erreicht werden.
Dies ist also eine Art biophysikalischer Beweis dafür,
dass es tatsächlich diesen sehr engen Zusammenhang zwischen Kanälen und Ausschüttungsorten gibt.
Und dass die Signalgebung hier sehr lokal erfolgt.
Wir haben viele Schritte in diesem Zusammenhang untersucht und natürlich haben wir eine Menge weiterer Ergebnisse erzielt.
Lassen Sie mich noch ein paar Worte zur Rolle des zyklischen AMP sagen.
Lassen Sie mich unten anfangen.
Wie ich gezeigt habe, ist Kalzium für das Auslösen der Exozytose wichtig.
Im Sinne von Molekülen geschieht dies durch sogenannte SNARE-Proteine, spezifische Moleküle,
die sich in der präsynaptischen Endigung befinden, und von denen man glaubt, dass Sie einen Komplex bilden,
um Vesikel und Membran zu verbinden.
Und dann vermutlich mit einem kalziumbindenden Protein namens Synaptotagmin zu interagieren,
um diese schnelle Antwort zu induzieren.
Wir betrachteten die Rolle des zyklischen AMP genauer und fanden heraus, dass dieser Auslöseschritt,
dieser sehr schnelle Vorgang immun war gegen alle Modulationen durch zyklisches AMP oder andere Dinge.
Daher scheint es, dass in diesem letzten Auslöseschritt nur Kalzium eine Rolle spielt.
Im vorausgehenden Schritt der Bildung dieser molekularen Maschinerie jedoch,
vermutlich auch beim Transport der Vesikel an die richtige Stelle, gibt es zwei Akteure.
Einerseits spielt Kalzium noch eine andere Rolle, die in einer sehr viel langsameren Zeitskala zum Tragen kommt, durch Calmodulin.
Und dann die Rolle des zyklischen AMP, vermutlich durch einen cAMP-abhängigen Nukleotidaustauschfaktor vermittelt.
Die beiden müssen zusammenarbeiten, um etwas zu erreichen, was als Priming bezeichnet wird,
und was sich auf einen letzten biochemischen Schritt bezieht, um ein Vesikel sekretionsbereit zu machen.
Außerdem betrachteten wir in einer Reihe anderer Untersuchungen die Rolle eines kinase-abhängigen Vorgangs
und konnten zeigen, dass die Phosphorylierung eines dieser sogenannten SNARE-Proteine, eines Proteins namens SNAP25,
bei dieser Priming-Reaktion tatsächlich wichtig ist.
Und wieder fanden wir heraus, dass die Phosphorylierung dieser Moleküle den Auslöseschritt nicht beeinflusst,
sondern nur diesen Priming-Schritt.
Und all diese Arbeit wurde natürlich nicht von mir selbst geleistet, sondern von jungen Forschern im Labor,
Takeshi Sakaba, einem Post-Doktoranden aus Japan, Ralf Schneggenburger, der jetzt Professor in Luzern in der Schweiz ist,
Nobutake Hosoi, der jetzt ein Post-Doktorand im Labor ist, Felix Felmy, der seine Doktorarbeit über diesen Vorgang schrieb.
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit.