Johann Deisenhofer

Structural Biology - Quo Vadis?

Category: Lectures

Date: 1 July 2008

Duration: 33 min

Quality: SD

Subtitles: EN DE

Johann Deisenhofer (2008) - Structural Biology - Quo Vadis?

Since the 1950s, with the first 3-D structures of DNA and hemoglobin/myoglobin, structural biology has made amazing progress

Thank you very much. The title is a little bit bombastic, I apologise, especially for a 30 minute talk, but I will see what I can do, especially if I can, ah yeah, here we are. Ok. So, speaking of Dallas, this is Dallas, Texas, downtown, and the UT Southwestern Medical Center is in the foreground, has a complicated outline, but basically this part and this part all belongs to the Medical Center. My laboratory is about here. First, let me get to a few historical remarks, beginning with Rosalind Franklin who, by her diffraction images of the B form of DNA, paved the way for Watson and Crick, their accurate model of the structure of DNA. And I think that can be called the big bang of structural biology. The first result that really made a big difference in biology. Then came our, the founding fathers of X-ray crystallography of proteins, Max Perutz and John Kendrew. And other technology, other methods were introduced, electron microscopy and nuclear magnetic resonance. Electron microscopy, I mention Aaron Klug with his structure determination of the Tobacco mosaic virus by electron microscopy. Then Richard Henderson and Nigel Unwin with their electron diffraction from two-dimensional crystals of bacteriorhodopsin. And last but not least Kurt Wüthrich and his colleagues, who developed NMR methods for the determination of three-dimensional macromolecular structures. And since then, structural biology has really taken off. This is a little bit strange orientation, so here is the year, increasing in this direction, and here are the number of structures deposited in the protein data bank, each one of these represents a set of numbers, the atomic coordinates of a particular macromolecule. And you can see, it took quite a while for the height of these bars to become visible, but around 1990 an exponential, probably exponential growth began, showing here the total number of structures deposited and the annual increase. Of course, 2008 is still incomplete. So, structural biology has come of age, and what were the main reasons for this? The main areas of progress, and here I have made a list, which is certainly incomplete, but I will put our ability to express proteins in heterologous systems, that is in organisms that in their native state don’t express a particular protein, and the ability to manipulate DNA on the top, because that allowed us to study proteins that occur naturally in low concentration and in organisms that are not easily accessible for getting material, such as humans, for example. And another big step is the advance of computing technology, everybody who tried to do computing in the 1960’s or even ‘70’s knows that a laptop can do a lot more than the super computer, a laptop of today can do a lot more than the super computer of that time. For crystallography, especially the availability of dedicated synchrotron X-ray sources, I think, was a very, very important step and it allowed such things as MAD or SAD phasing, which stands for multi-wavelength anomalous dispersion or single-wavelength anomalous dispersion, which largely diminished the need for making heavy atom derivatives. And I should also mention crystal freezing, which maybe, may sound like a trivial point, but it is extremely important to allow rapid data collection at very powerful synchrotron sources without immediately destroying the crystal. I would like to say a few more words about synchrotron. The use of synchrotron sources started, as far as I know… In biology, synchrotron sources in biology, as far as I know, started with this article in "Nature" by Gerd Rosenbaum and Ken Holmes from Heidelberg and Jean Witz from Strasbourg. And they proposed to use synchrotron radiation for fibre diffraction in muscles. They were very frustrated with the fact that to take a fibre diagram of a muscle took an hour or so and there was no way of… With the laboratory source, took an hour, and there was no way in ever studying a muscle that contracts and expands. So they looked for stronger X-ray sources, and they looked at synchrotrons, in this case the DESY in Hamburg. And from then on, synchrotrons became a fixture in X-ray generation, first as parasitic, in a parasitic mode, where the users of synchrotron radiation were totally subject to the program that was determined by the needs of the physics community, but then dedicated synchrotrons were built, here approximately, and then so-called third generation, really advanced machines. I should say that, of course, this is the time, here is the peak brilliance of the synchrotron source, brilliance is defined here at the bottom. And compared to X-ray tubes, synchrotrons already, even the first generation meant about three or four orders of magnitude increase in brilliance. And with the improvement of synchrotrons, this came to many orders of magnitude, like 15 or so. And yet, people are still not satisfied. We still want to go to higher brilliance, because mainly, if I think of my own laboratory, we have been trying to grow crystal for 20 years now, and one common characteristic of all these crystals is that they get smaller and smaller. I don’t know why this is so, but, in other words, we try to do diffraction experiment with very tiny crystals and, consequently, we need stronger X-ray sources. But it also has to be said that in this area here, with the, really the cutting-edge synchrotrons of today, we sometimes have to attenuate the beam to trade a balance between radiation damage, even though the crystal is frozen, and the necessary diffracted intensity. So, here you see this point on the top, this is another nine or ten orders of magnitude increase, and that is supposed to come from a new kind of device called free-electron laser. I think one of them already exists, producing ultra violet radiation, at Hamburg, but several are under construction, one in Stanford and one in Hamburg, that should be able to produce X-rays in the order of 1 angstrom or 1 ½ angstrom wavelengths. And if I complain about radiation damage in this situation here, there is no doubt that radiation damage is the major problem, if it is a problem in this area. So we cannot really hope to put a crystal in the path of such a beam, in such brilliance. But before I go further, here is a schematic from DESY of the X-ray free-electron laser, which is essentially an accelerated electron beam that goes through a series of magnets of the magnetic field, which is from up down, up down. And that forces the beam to wriggle here, and this principle is also used in insertion devices in synchrotrons, but the geometry and the energy of the electrons etc. are such that stimulated emission takes place and a coherent beam of X-rays is emitted in this direction, then the electrons are taken out of the way, and this is the actual, the beam that can be used for experiments. And, as I said, radiation damage will be a huge problem, if it is a problem, and people have thought about, ok, if we have such a high brilliance, then we can try to do diffraction or diffraction experiments on single molecules. And how would the single molecule behave under an intense pulse of X-rays? Now I have to say that the pulses are supposed to be in the order of about 20, 50 femtoseconds, I’m not entirely sure what the technical specifications would be of the new machines, but Janos Hajdu and his colleagues did a calculation of what happens to a protein molecule after it's been hit by a very strong X-ray pulse, and, essentially, it loses a lot of its electrons due to the photoelectric effect. So it gets extremely positively charged and it explodes. But the question is, how fast is this explosion? And here they come to the conclusion that really visible effects started about ten femtoseconds after the beginning of the pulse. So if the pulse is short enough, like in this region, then one can get useful diffraction from a relatively undistorted molecule during that time. And so that is the basis for the hope, that this kind of machine can do something for structural biology. The idea is that we have here an X-ray beam, a detector, a pulse monitor, and the proteins come in the form of, protein molecules come in the form of particle stream and are similar to what is nowadays used in mass spectrometers or similar machines. So that technology is available, and they come in random orientation, they are hit by the beam, explode later, but for each particle there is a diffraction diagram recorded. Then these diagrams are classified according to orientations of the molecule, averaged, put together and then the structure is reconstructed. So that is the hope and we shall see how this evolves. The X-ray free-electron laser in Hamburg is going to be, I think, is planned to be operational in 2013, so everyone of the young people here who is interested in this kind of thing is… This is just the right time to begin thinking about experiments with these machines. So let me now come to another part, and that is how, with all these many protein structures that we have available now in the Protein Data Bank, have we come to a point where we really understand proteins? And I have to say that I’m thinking it’s not yet the case. The question is, can we make reliable predictions in structural biology, given structural data? And to illustrate the point, I bring this example: It is a relatively simple question of signal transduction, sorry, through a bacterial outer membrane in the ferric dicitrate transporter FecA. So this is a protein of about 750 amino acids, it looks like this. It sits in the outer membrane of a gram-negative bacterium. Here is the periplasmic space. Way down below is the inner membrane, and its business is to bind ferric dicitrate, which is a form of dissolved ferric iron, in order to fulfil the iron needs of the bacterium. Each bacterium needs a few thousand iron atoms to function, in various prosthetic groups, in various arrangements and proteins, and without that bacteria cannot grow. So they try to get hold of iron, and we have, we, that is Andrew Ferguson, a former post-doc, have determined structures of, first of all, this is a signalling domain which I will not mention any further, that was done by NMR, by Andrew, and then we had two structures of this protein, one without and one with the ferric dicitrate. And here’s the comparison of these two forms, unliganded and ferric dicitrate bound. Here again, this is the plane of the membrane. And let's first look at this, on the left, on your left side, there is the binding side of ferric citrate empty and the protein itself forms a 22-stranded beta barrel. So there are 22 of these strands of beta structure, typical for outer membrane proteins. And that defines a channel for the membrane, about 25 angstroms in diameter. And in this channel sits another domain of 150 amino acids. This integral part of this protein, which we call the plug, for obvious reasons, it closes the hole that would otherwise be formed through the outer membrane. And the protein has very short connecting loops between beta strands here, and long ones between beta strands here. Now, when ferric dicitrate binds in this position, in this region, there are two major changes involving two loops called L8 and L7. If we compare these two pictures, the L8 folds over the ferric dicitrate, the L7 loses its helix and undergoes conformational change. Then there’s a region where nothing seems to happen, no difference. And down here, it’s perhaps not so easy to see, but in the unliganded form, now the laser is running out, but in the unliganded form you have here a helix, the polypeptide chain comes in here, forms a short helix and then continues into the plug domain. This helix has dissolved in the liganded form, and this serves a very clear purpose: It signals to a protein called TonB that iron is bound in the binding side, and then this TonB is a sort of an energy transducing molecule that then, we assume, pulls on the plug domain and tries to get the iron through. Most likely pulls the iron out. And our question is now, if, so I’ve stated here, ligand binding at the outside causes conformational change at the periplasmic side, the structures of plug domains in unliganded and liganded states are identical, if so, and what causes that conformational change? So there is no sort of contiguous conformational change… Ok. Yeah, thanks. There's no contiguous region of conformational change and it would be, it's one of the challenges that we face in every protein structure, to understand what is the reason, how does, how is the signal sent? And we can use various theoretical methods, modeling, normal mode analysis, maybe the iron binding changes, the spectrum of vibrations of the molecule, molecular dynamics calculations. But so far and in this latter case we don’t really know the time frame, so, how long does it take from the binding of the ligand to the dissolution of this helix? How long does it take to transmit the signal? And if it is more than a few nanoseconds, then it is out of reach for molecular dynamics, because it will take years to calculate. So we resorted to a different method, and I begin to run out of time, which is based on the following assumptions: There are many homologous, proteins homologous to FecA, several hundred, maybe 500, known in the ever-growing sequence databases. If a common signalling mechanism exists, then functionally important residues should co-evolve. That is, if there’s a chain of residues sending this signal, if one of them mutates, neighbouring ones may mutate, too. One of my colleagues developed a method called Statistical Coupling Analysis to look for such co-evolving residues, and then they should have, if they are found, they should have a measurable functional effect, when they are mutated, for example. And we did that, but I won’t talk about it. So here is the idea of Statistical Coupling Analysis, developed by Rama Ranganathan and his students. Essentially, you look at a large sequence alignment, let’s say 100 sequences, and you find a place where 60% are histidine and 40% are valine. Then you look at all the other places in the sequence and you look whether the distribution of residues in any of these other places changes if you take only the 60% histidine or the 40% valine. That is the basic idea and they express this in a number they call "delta delta G statistical ij", which is how much the amino acid distribution in position "j" has changed upon selection of a particular amino acid in the distribution at position "i". And that is a relatively straightforward calculation once you have put together the sequences. And in the case of FecA, this was the result. There are the two forms of the molecule, in yellow and blue. Here is the ferric dicitrate in the form of a surface model. And also in the form of a surface model are the residues that were found as statistically coupled. The red ones also belong to that group, but these were the ones in which actual experiments in the form of mutations were carried out. And if we cut, so this is a view parallel to the membrane, we cut it in three, the protein in three layers parallel to the membrane, you see that these residues are, the coupled residues are concentrated on one side, connected to the binding side, still concentrated on one side in the middle and then spread out in the lower part of the molecule that’s near the periplasmic surface of the protein. And we were starting to write up the paper, when two other papers came out, two very related papers. They showed the binding of TonB in two different transporter molecules, this is another iron transporter, this is vitamin B12 transporter, and there was very interesting interaction between the N-terminal peptide of the transporter molecule and the TonB fragment that was used. But also interesting was that the TonB combined in two different sites, one more to the right side and one more to the middle or left side, and that’s where the branching chain of statistically coupled residues are leading to. And this is all good, but there is, this is strictly, I mean, this can be done without knowing the structure. It is strictly based on statistical analysis of sequence alignment, but there is no physical explanation why this is so. And, of course, it doesn’t detect strictly conserved residues, because then the method cannot be applied. So that is kind of a way out, but not really satisfactory, and I wish we were in the position of physics, I mean, I found this quote by Eugene Wigner, where he celebrates the fact that mathematics can express physical laws in wonderful, just think of the Maxwell's equations. So this is certainly not the situation in biology, much more fitting is this quote by Frank Wilczek which says "turbulence, friction and protein folding, for example, are technologically important and ubiquitous phenomena in the natural world, but despite much effort, they remain largely mathematical wilderness". And that’s where we are today. I don’t know and I hope we will not forever stay there, and it is a challenge to all the young people here to find a path through the wilderness. And I think this is a very worthy goal. So here, maybe, that’s perhaps one way to do it, is to find a reliable way to simplify atomic models, maybe, but I’m not sure whether this is the way. And from time to time it is worthwhile to think about this question that I first heard from Sydney Brenner, And even that question is very, very difficult to answer, because we don’t know what everything is. So, I close with that, thank you for your attention.

Vielen Dank. Bitte entschuldigen Sie, der Titel ist ein wenig bombastisch, insbesondere für einen 30-minütigen Vortrag, aber ich will sehen, was ich tun kann, vor allem ob ich... Ah, okay, jetzt hab ich's. Apropos Dallas, das hier ist die Innenstadt von Dallas, Texas mit dem Southwestern Medical Center der UT im Vordergrund; sie hat einen komplexen Grundriss, aber hauptsächlich in diesem Bereich, dieser ganze Teil gehört zum Medical Center. Mein Labor befindet sich etwa hier. Ich möchte zunächst einige historische Anmerkungen machen, beginnend mit Rosalind Franklin, die mit ihren Röntgenbeugungsaufnahmen der B-Form der DNA den Weg für das präzise Modell der DNA-Struktur von Watson und Crick ebnete. Ich denke, man kann das als Urknall der strukturellen Biologie bezeichnen, das erste Ergebnis, das wirklich einen großen Unterschied in der Biologie machte. Dann kamen Max Perutz und John Kendrew, die Gründungsväter der Protein-Röntgenkristallographie, und es wurden weitere Technologien und Methoden eingeführt wie z.B. die Elektronenmikroskopie und Kernspinresonanz. Bei der Elektronenmikroskopie möchte ich Aaron Klug mit seiner elektronenmikroskopischen Strukturbestimmung des Tabakmosaikvirus erwähnen. Dann Richard Henderson und Nigel Unwin mit ihrer Elektronenbeugung zweidimensionaler Bacteriorhodopsinkristalle. Und zu guter Letzt Kurt Wüthrich und seine Kollegen, die NMR-Verfahren zur Bestimmung dreidimensionaler Makromolekülstrukturen entwickelten. Seit damals boomt die strukturelle Biologie. Die Anordnung ist ein bisschen seltsam, also hier ist die Jahreszahl, die in diese Richtung ansteigt, und hier ist die Anzahl der in der Proteindatenbank hinterlegten Strukturen. Jede von ihnen besteht aus einem Zahlensatz, den Atomkoordinaten eines bestimmten Makromoleküls. Wie Sie sehen können, dauerte es eine ganze Weile, bis diese Balken sichtbar wurden, doch um das Jahr 1990 begann ein wahrscheinlich exponentielles Wachstum. Hier sehen Sie die Gesamtanzahl der hinterlegten Strukturen und den jährlichen Anstieg; Die strukturelle Biologie ist also erwachsen geworden. Welche Hauptgründe gab es hierfür? Was sind die wichtigsten Bereiche, in denen Fortschritte erzielt wurden? Ich habe hier eine Liste gemacht, die sicherlich nicht vollständig ist, aber ich möchte nicht nur unsere Fähigkeit zur Exprimierung von Proteinen in heterologen Systemen, d.h. in Organismen, die in ihrem ursprünglichen Zustand kein spezielles Protein exprimieren, herausstellen, sondern vor allem unsere Fähigkeit zur DNA-Manipulation, denn sie ermöglichte uns die Untersuchung von Proteinen, die natürlicherweise in geringer Konzentration und in für eine Materialgewinnung nicht leicht zugänglichen Organismen wie z.B. dem Menschen vorliegen. Ein weiterer großer Schritt ist der Fortschritt in der Computertechnik. Jeder, der sich in den 60er oder sogar 70er Jahren an Computerarbeit versucht hat, weiß, dass der Laptop von heute viel mehr kann als ein damaliger Supercomputer. Für die Kristallographie war meiner Ansicht nach insbesondere die Verfügbarkeit spezifischer Synchrotronröntgenstrahlungsquellen ein außerordentlich wichtiger Schritt und ermöglichte Verfahren wie MAD- oder SAD-Synchronisation (MAD = anomale Diffraktion bei mehreren Wellenlängen; SAD = anomale Diffraktion bei einer Wellenlänge), wodurch die Notwendigkeit der Erzeugung schwerer Atomderivate stark abnahm. Ich sollte auch das Einfrieren der Kristalle erwähnen; das klingt vielleicht trivial, aber an sehr starken Synchrotronquellen ist eine rasche Datenerfassung ohne unmittelbare Zerstörung des Kristalls überaus wichtig. Ich möchte noch ein paar Worte zum Synchrotron sagen. Der Einsatz von Synchrotronquellen in der Biologie begann, soweit ich weiß, mit diesem Artikel in "Nature" von Gerd Rosenbaum und Ken Holmes aus Heidelberg und Jean Witz aus Straßburg. Sie schlugen den Einsatz von Synchrotronstrahlung für die Röntgenbeugung von Muskelfasern vor. Sie waren äußerst frustriert, dass die Darstellung einer Muskelfaser mit der Röntgenquelle im Labor eine Stunde oder länger dauerte und es keine Möglichkeit gab, einen kontrahierenden bzw. expandierenden Muskel zu untersuchen. Also machten sie sich auf die Suche nach stärkeren Röntgenquellen wie Synchrotronen, in diesem Fall DESY in Hamburg. Ab diesem Zeitpunkt wurden Synchrotrone zur festen Einrichtung bei der Röntgenstrahlerzeugung. Zunächst waren die Nutzer der Synchrotronstrahlung allerdings völlig abhängig von dem Programm, das von den Bedürfnissen der physikalischen Fachwelt bestimmt wurde, doch dann wurden Spezialsynchrotrone gebaut, etwa zu diesem Zeitpunkt, und danach hochmoderne Vorrichtungen der sogenannten dritten Generation. Ich sollte natürlich noch sagen, hier ist die Zeit, hier die stärkste Brillanz der Synchrotronquelle. Brillanz ist hier unten definiert. Im Vergleich zu Röntgenröhren liegt selbst bei Synchrotronen der ersten Generation die Brillanz bereits um drei bis vier Größenordnungen höher. Mit zunehmender Verbesserung der Vorrichtungen wurde ein Anstieg um zahlreiche Größenordnungen (etwa 15) erreicht. Doch wir sind immer noch nicht zufrieden, wir wollen eine noch höhere Brillanz. Wenn ich an mein eigenes Labor denke, versuchen wir seit nunmehr 20 Jahren Kristalle zu züchten, und ein gemeinsames Merkmal all dieser Kristalle ist, dass sie immer kleiner werden. Ich weiß nicht, warum das so ist, aber anders gesagt versuchen wir Röntgenbeugungsexperimente mit winzigsten Kristallen durchzuführen und benötigen demzufolge stärkere Röntgenquellen. Es muss aber auch erwähnt werden, dass wir in diesem Bereich mit den wirklich hochmodernen Synchrotronen, die es heute gibt, den Strahl auch zuweilen abschwächen müssen, um das Gleichgewicht zwischen Strahlungsschäden auch bei dem gefrorenen Kristall und der notwendigen Beugungsintensität auszutarieren. Hier sehen Sie diesen Punkt da oben, das ist ein Anstieg um weitere neun oder zehn Größenordnungen. Die Aufnahme stammt angeblich von einer neuen Art Vorrichtung, dem sogenannten Freie-Elektronen-Laser. Ich glaube, einen solchen Laser gibt es bereits, er erzeugt ultraviolette Strahlung und steht in Hamburg. Mehrere andere befinden sich derzeit im Bau, einer in Stanford und einer in Hamburg; sie sollen Röntgenstrahlung einer Wellenlänge in der Größenordnung von 1 oder 1,5 Angström erzeugen können. Wenn ich mich an dieser Stelle über Strahlungsschäden beklage, besteht kein Zweifel, dass Strahlungsschäden, wenn sie denn ein Problem in diesem Bereich darstellen, das Hauptproblem sind. Wir können also nicht wirklich hoffen, einen Kristall einem Strahl einer derartigen Brillanz auszusetzen. Bevor ich fortfahre, habe ich hier eine schematische Darstellung des Freie-Elektronen-Röntgen-Lasers von DESY, bei dem es sich im Wesentlichen um einen beschleunigten Elektronenstrahl handelt, der sich zwischen einer Reihe von Magneten in einem Magnetfeld von oben nach unten bewegt. Dadurch wird der Strahl gezwungen sich an dieser Stelle zu schlängeln. Dieses Prinzip kommt auch bei Insertion Devices in Synchrotronen zum Einsatz, doch die Geometrie und die Energie der Elektronen usw. sind dort dergestalt, dass eine stimulierte Emission stattfindet und ein kohärenter Röntgenstrahl in diese Richtung ausgesendet wird. Anschließend werden die Elektronen abgezogen, und das ist dann der eigentliche Strahl, der für Experimente genutzt werden kann. Wie ich bereits sagte, stellen Strahlungsschäden, wenn sie denn problematisch sind, ein großes Problem dar. Die Leute dachten, nun ja, wenn wir schon eine solch hohe Brillanz haben, können wir auch eine Röntgendiffraktion bzw. Röntgendiffraktionsexperimente an Einzelmolekülen durchführen. Wie würde sich ein Einzelmolekül unter einem intensiven Röntgenpuls verhalten? Nun, ich muss dazu sagen, die Pulse sollten in einer Größenordnung von etwa 20 bis 50 Femtosekunden liegen. Ich bin nicht ganz sicher, wie die technischen Spezifikationen der neuen Vorrichtungen aussehen würden, aber Janos Hajdu und seine Kollegen haben berechnet, was mit einem Proteinmolekül geschehen würde, wenn es von einem sehr starken Röntgenpuls getroffen wird: Es verliert im Wesentlichen aufgrund des photoelektrischen Effekts viele seiner Elektronen, wird dadurch stark positiv geladen und explodiert. Die Frage ist jedoch, wie rasch erfolgt diese Explosion? Hier kommt Hajdu zu dem Schluss, dass erste tatsächlich sichtbare Effekte etwa zehn Femtosekunden nach Beginn des Pulses auftreten. Ist der Puls also wie in diesem Bereich kurz genug, lässt sich in dieser Zeit eine brauchbare Diffraktion von einem relativ unverfälschten Molekül erzielen. Hierauf gründet also die Hoffnung, dass diese Vorrichtung einen Beitrag zur strukturellen Biologie leisten kann. Die Idee ist, dass wir hier einen Röntgenstrahl, einen Detektor und einen Pulsmonitor haben und die Proteinmoleküle in Form eines Teilchenstroms vorliegen, ähnlich denen, die heute in Massenspektrometern oder ähnlichen Vorrichtungen eingesetzt werden. Diese Technologie steht also zur Verfügung. Die Teilchen sind zufällig ausgerichtet, werden von dem Strahl getroffen und explodieren später, doch für alle Teilchen werden Diffraktionskurven aufgezeichnet, die dann nach Molekülausrichtung klassifiziert, gemittelt und zusammengesetzt werden. Anschließend wird die Struktur rekonstruiert. Das ist also unsere Hoffnung, wir werden sehen, wie sich die Dinge entwickeln. Der Freie-Elektronen-Röntgen-Laser in Hamburg soll meines Wissens nach 2013 in Betrieb gehen; wer von den jungen Leuten hier sich also für diese Thematik interessiert ... Der Zeitpunkt ist jetzt genau richtig, um allmählich über Experimente mit diesen Apparaturen nachzudenken. Lassen Sie mich nun zu einem anderen Teil meines Vortrags kommen. Sind wir angesichts all dieser vielen Proteinstrukturen, die uns jetzt in der Proteindatenbank zur Verfügung stehen, an einen Punkte gekommen, an dem wir Proteine wirklich verstehen? Ich muss sagen, dass dies meiner Ansicht nach noch nicht der Fall ist. Die Frage ist: Können wir in der strukturellen Biologie verlässliche Vorhersagen treffen, Strukturdaten liefern? Hier ein Beispiel, um diesen Punkt zu veranschaulichen: Es ist eine relativ simple Frage der Signaltransduktion durch eine äußere Bakterienmembran in den Eisendicitral-Transporter (FecA). Dabei handelt es sich um ein aus etwa 750 Aminosäuren bestehendes Protein, das so aussieht. Es befindet sich in der äußeren Membran eines gram-negativen Bakteriums. Hier ist der periplasmatische Raum, weiter unten die innere Membran, deren Aufgabe die Bindung von Eisendicitrat (gelöstem dreiwertigem Eisen) ist, um das Bakterium mit Eisen zu versorgen. Jedes Bakterium benötigt, um funktionsfähig zu sein, einige tausend Eisenatome in verschiedenen prosthetischen Gruppen, Anordnungen und Proteinen. Ohne sie können Bakterien nicht wachsen, weswegen sie versuchen Eisen zu binden. Wir, das heißt Andrew Ferguson, ein früherer Postdoc, hat zunächst einige Strukturen bestimmt... Dies ist eine Signaldomäne, die ich nicht weiter erläutern möchte; Andrew hat sie mittels NMR dargestellt. Zum Schluss hatten wir zwei Strukturen dieses Proteins, eine ohne und eine mit Eisendicitrat. Hier sehen Sie den Vergleich dieser beiden Formen, ohne Ligand und mit gebundenem Eisendicitrat. Das hier ist wieder die Membranebene. Schauen wir uns zunächst die linke Seite an, also von Ihnen aus gesehen links: Dort ist die Bindungsstelle für Eisencitrat leer und das Protein selbst erzeugt einen 22-strängigen Beta-Barrel. Es liegen also 22 dieser Beta-Struktur-Stränge vor, was für Proteine einer äußeren Membran typisch ist. Hierdurch wird ein Kanal eines Durchmessers von etwa 25 Angström für die Membran definiert, in dem sich eine weitere, aus 150 Aminosäuren bestehende Domäne befindet. Dieser wesentliche Teil des Proteins, das wir aus offensichtlichen Gründen als "plug" (Stöpsel) bezeichnen, verschließt die Öffnung, die ansonsten in der äußeren Membran entstehen würde. Das Protein verfügt über sehr kurze Verbindungsschleifen zwischen den Beta-Strängen hier und über lange zwischen den Beta-Strängen hier. Wenn sich nun Eisendicitrat in dieser Position, in diesem Bereich bindet, kommt es zu zwei großen, die Schleifen L8 und L7 betreffenden Veränderungen. Wenn wir diese beiden Abbildungen vergleichen, faltet sich L8 über das Eisendicitrat und L7 verliert seine Helix, durchläuft also eine Konformationsänderung. Hier ist ein Bereich, in dem nichts zu passieren scheint, kein Unterschied. Hier unten - das ist vielleicht nicht so gut zu sehen, weil der Laser schwächer wird - besitzt die Form ohne Ligand eine Helix; die Polypeptidkette kommt von hier, bildet eine kurze Helix und bewegt sich dann weiter in die Plug-Domäne. Diese Helix hat sich in der Form mit Ligand aufgelöst, was einem ganz eindeutigen Zweck dient: Es signalisiert einem Protein namens TonB, dass Eisen an der Bindungsstelle gebunden ist. TonB ist eine Art Energietransduktionsmolekül, das nun, so nehmen wir an, an der Plug-Domäne reißt und das Eisen wahrscheinlich herauszieht. Wir fragen uns nun: Wenn, wie ich es geschildert habe, die Ligandenbindung an der Außenseite zu einer Konformationsänderung an der periplasmatischen Seite führt, sind die Strukturen der Plug-Domänen dann im Zustand ohne und mit Ligand identisch und wenn ja, wodurch wird diese Konformationsänderung ausgelöst? Es gibt keine zusammenhängende Konformationsänderung... Ok. Ja, danke. Es gibt keine zusammenhängende Region der Konformationsänderung. Das ist eine der Herausforderungen, denen wir uns bei jeder Proteinstruktur gegenübersehen, zu verstehen, warum und wie das Signal gesendet wird. Wir können verschiedene theoretische Methoden anwenden, Modelle, Normalmodenanalyse, vielleicht die Änderungen der Eisenbindung, das Vibrationsspektrum des Moleküls, molekulardynamische Berechnungen. Doch bislang kennen wir in letzterem Fall den Zeitrahmen nicht wirklich. Wie lange dauert es von der Bindung des Liganden bis zur Auflösung dieser Helix? Wie lange dauert die Signalübertragung? Wenn sie mehr als einige Nanosekunden dauert, liegt sie außer Reichweite der Molekulardynamik, denn dann würde die Berechnung Jahre dauern. Wir griffen also auf ein anderes Verfahren zurück - mir läuft langsam die Zeit davon -das sich auf folgenden Annahmen gründet: In den stetig wachsenden Sequenzdatenbanken finden sich zahlreiche zu FecA homologe Proteine, mehrere Hundert, vielleicht 500. Wenn ein gemeinsamer Signalgebungsmechanismus existiert, sollte eine Koevolution funktionell bedeutender Aminosäurereste erfolgen. Mutiert in einer dieses Signal aussendenden Kette von Aminosäureresten ein Rest, mutieren vielleicht die angrenzenden Reste ebenfalls. Einer meiner Kollegen entwickelte für die Suche nach diesen koevolvierenden Resten die sogenannte statistische Kopplungsanalyse. Die Aminosäurereste sollten einen messbaren funktionellen Effekt haben, z.B. wenn sie mutiert sind. Wir taten, was wir taten, aber reden nicht darüber. Das hier ist das Konzept der von Rama Ranganathan und seinen Studenten entwickelten statistischen Kopplungsanalyse. Sie sehen im Wesentlichen ein großes Sequenzalignment, sagen wir 100 Sequenzen. An einer Position besitzen 60% der Sequenzen Histidin und 40% Valin. Dann schauen Sie sich alle anderen Positionen in der Sequenz an und prüfen, ob sich die Verteilung der Aminosäurereste an einer dieser anderen Positionen ändert, wenn man nur die 60% Sequenzen mit Histidin bzw. die 40% Sequenzen mit Valin nimmt. Das ist das Grundprinzip, das sich durch die statistische Kopplungsenergie (Delta Delta Gi, j hoch stat) ausdrücken lässt; sie gibt an, wie stark sich die Verteilung der Aminosäuren in Position "j" bei Wahl einer bestimmten Aminosäure bei der Verteilung in Position "i" verändert. Hierbei handelt es sich um eine relativ unkomplizierte Berechnung, sobald man die Sequenzen zusammengesetzt hat. Im Falle von FecA sah das Ergebnis so aus: Hier sind die beiden Formen des Moleküls, gelb und blau. Das ist das Eisendicitrat in Form eines Oberflächenmodells. Die Aminosäurereste, die sich als statistisch gekoppelt erwiesen hatten, sind ebenfalls als Oberflächenmodell dargestellt. Die roten Reste gehören auch zu dieser Gruppe, aber an diesen hier haben wir die eigentlichen Experimente in Form von Mutationen durchgeführt. Das hier ist die Ansicht parallel zur Membran nach einem Schnitt. Wenn wir drei Schnitte vornehmen, das Protein also in drei Schichten parallel zur Membran liegt, sehen Sie, dass diese gekoppelten Reste bis zur Mitte auf einer Seite konzentriert und an die Bindungsposition gebunden sind, sich im unteren Bereich des Moleküls, d.h. in der Nähe der periplasmatischen Oberfläche des Proteins jedoch ausbreiten. Zeitgleich mit der Entstehung unseres Papers wurden zwei andere, sehr ähnliche Paper veröffentlicht, die die Bindung von TonB an zwei verschiedene Transportermoleküle beschrieben, nämlich einen weiteren Eisentransporter und einen Vitamin B12-Transporter. Zwischen dem N-terminalen Peptid des Transportermoleküls und dem verwendeten TonB-Fragment traten äußerst interessante Wechselwirkungen auf. Interessant war aber auch, dass sich TonB an zwei verschiedenen Positionen - eine eher auf der rechten Seite, die andere eher in der Mitte bzw. links - fusionierte. Genau dorthin aber führt die verzweigte Kette der statistisch gekoppelten Aminosäurereste. Das ist alles gut und schön, doch genaugenommen ist diese Arbeit ohne Kenntnis der Struktur nicht möglich. Die Ergebnisse beruhen zwar zweifellos auf der statistischen Analyse des Sequenzalignments, doch es gibt keine physikalische Erklärung für sie. Selbstverständlich werden dabei auch keine stark konservierten Reste nachgewiesen, denn in einem solchen Fall lässt sich das Verfahren nicht anwenden. Hiermit möchte ich zum Ende kommen, auch wenn es kein wirklich zufriedenstellendes Ende ist und ich wünschte, wir wären in der Lage, in der sich die Physik befindet. Ich habe dieses Zitat von Eugene Wigner entdeckt, worin er die Tatsache bewundert, dass die Mathematik physikalische Gesetze ausdrücken kann. Denken Sie nur an die Maxwellschen Gleichungen. In dieser Situation befindet sich die Biologie sicherlich nicht. Wesentlich passender ist da dieses Zitat von Frank Wilczek, der sagte, dass "beispielsweise Turbulenz, Reibung und Proteinfaltung zwar technologisch bedeutende und universelle Phänomene in der natürlichen Welt sind, trotz umfassender Bemühungen aber noch immer weitgehend mathematische Wildnis darstellen". Genau da sind wir heute. Ich weiß es nicht, aber ich hoffe, dass wir nicht für immer an diesem Punkt stehenbleiben. Es ist eine Herausforderung für all die jungen Leute hier, einen Pfad durch die Wildnis zu suchen, und das Ziel ist meiner Ansicht nach ein sehr lohnendes. Vielleicht besteht eine Möglichkeit darin, Atommodelle zuverlässig zu vereinfachen, aber ich bin mir nicht sicher, ob das die Lösung ist. Man sollte aber gelegentlich über eine Frage nachdenken, die ich das erste Mal von Sydney Brenner gehört habe: was "alles" ist. Damit möchte ich schließen. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit.


Since the 1950s, with the first 3-D structures of DNA and hemoglobin/myoglobin, structural biology has made amazing progress. The Protein Data Bank now holds atomic coordinates for over 50,000 individual macromolecular structures (~43,000 determined by X-ray crystallography, ~7,000 by nuclear magnetic resonance, and ~170 by electron microscopy). Much of the success has been enabled by progress in related fields, such as recombinant DNA technology, computing, synchrotron X-ray sources, superconducting magnets, etc.

While methods development in crystallography, NMR, and Electron Microscopy is continuing, new opportunities for experimental structure determination will arrive when the free electron lasers currently under construction in Stanford (LCLS, 2009) and Hamburg (XFEL, 2013), become operational. Because of the intensity and the time structure of the radiation generated at these facilities, it may become possible to collect X-ray scattering data from a single biological macromolecule within a few femtoseconds. This may lead to a whole new approach to structure determination.

An area in which progress has been slower than many of us hoped is the theoretical understanding of macromolecules, including computer simulations and predictions about their function and their behaviour in response to mutations or to changes in their environment. Here may be the greatest opportunity for todays young generation of scientists to make significant contributions to biomedical science.