It is my pleasure to introduce the next speaker,
Professor Robert Huber from the Max Planck Institute of Biochemistry in Martinsried.
He received the Nobel Prize for Chemistry in 1988 together with Deisenhofer and Michel for
That also marked the first crystallization and structure analysis of a membrane protein.
I still remember the exciting time, not only for the photosynthesis community but also for biochemistry,
biophysics and medical research in general.
Professor Huber will talk about a related topic:
proteolysis and its regulation and molecular basis.
What you see here is the faith of an emeritus who has not yet learned to say no.
I am very pleased to be in Lindau which is a very beautiful place of my home country Bavaria
to meet students and advertise my field of expertise which is protein crystallography
and perhaps convince some of you to enter this field, too.
I was very pleased to listen to Professor Blobel,
the previous speaker who made a splendid advertisement of protein crystallography.
So I would like to continue with that.
It is a relatively young field of research.
The father of it was Max Perutz working in Cambridge, England.
But it has undergone a major transformation in the last 20 years by the technical and methodical developments
which originate actually in different fields, in gene technology, recombinant proteins,
high energy physics, computing and computer graphics.
I will not speak about protein crystallography but let the results and biological implications
of high resolution protein structures speak for themselves, as you have already so nicely seen in Blobel’s talk.
The system I have chosen is proteases, a field in which I have worked since the late ‘60s.
Of course during my career I have followed many other side lines, worked on other systems,
perhaps the one best known is proteins of photosynthesis
which led to the Nobel Prize 1988 together with Hartmut Michel and my former doctoral student Johann Deisenhofer.
Back to the proteases.
A very simple chemical reaction, hydrolysis of a peptide bond, hot acid or hot base does it as you know,
but in nature there are enzymes.
And the surprising fact is that there are many enzymes.
About 3% of all the genes throughout the animal and plant and bacterial world encode proteinases.
Unique is, apart from the amount of proteinases that we have, the fact of their diversity, structurally and mechanistically.
They are usually grouped into, according to the major nucleophile, we find the serine, the threonine, metalloproteinases.
But also within these groups there is diversity.
A classical one is the common principle mechanism of the trypsin-like protease family and the subtilisin-like protein family.
So totally unrelated proteases but sharing the same proteolysis, mechanism of proteolysis.
Now, the reason for the abundance and the diversity of proteases is their involvement in physiological processes.
One of them I show here.
This is the blood coagulation cascade leading from a wound to a thrombus by a series of activation steps
which involve proteolytic, limited proteolytic activity.
Of course this process is highly regulated.
There are inhibitors, there are components which counteract this.
One I will come to is the protein C as you will see later.
Now, the last component, the component which makes the thrombus by cleaving fibrinogen is called factor II or thrombin.
I come back to that as an example several times later.
So again, the diversity that we see in the protease field is due to the fact
that limited proteolysis is a major physiological regulatory mechanism.
This diversity of proteolytic structure and mechanism is correlated with the diversity of regulation of proteolytic activity.
This is the topic of my talk this morning.
In this scheme I have tried to categorize these various kinds, principle base of regulating protease activity.
I go through one by one showing examples.
I begin with the simplest one, namely the inhibition of a protease by a protein
which is sterically complementary to the substrate binding site.
This we have found is the first example in the late ‘60s, early ‘70s.
Here you see trypsin in a complex with the basic pancreatic trypsin inhibitor which we not only studied as a complex
but also the individual components to find out that there is no structural change except slight peripherals,
external site chain movements, no structural change when these two components combine.
So pre-form to structural complementarity.
Later we looked at other protease classes.
This is the serine protease class, trypsin-like proteinases, here we have the papain-like and here we have the metalloprotease.
We find that principle over and over again.
Pre-formed sterical complementarity, no structural change.
There is some variation in the extent to which the inhibitor mimics the substrate, binds like the substrate.
Here we have the serine protease case.
In the cystein protease case we have only part of the substrate binding site occupied by an inhibitor segment.
In the case of the metalloproteases we have very extensive, so called exocyte interactions.
These inhibitors called TIMPs are much larger than the protease they inhibit, they so to speak engulf it almost.
So very extensive exocyte interactions to make a very strong and specific interaction.
The surprise came in the ‘80s when we looked at the inhibitors of serine proteases which are in our blood.
They are the guardians in our blood, guardians against unwanted coagulation for instance and many other processes.
They are very large proteinase, serine proteinase inhibitors and they occur in various forms.
They occur in an active form which has a complementary binding surface,
complementary to the substrate binding site of the protease but they also occur in a latent form, which is an isomer.
Chemically absolutely identical, but this loop structure here is partly inserted into this beta sheet structure here.
And they occur in a cleaved form.
So after having done their job, they are cleaved by the protease
and then they rearrange in a way that this red segment is inserted into this beta sheet and they occur in the complex form.
The protease first interacts on top here and then cleaves the susceptible peptide bond of the inhibitor
and then rearranges to the other side.
It’s a very much more complex scheme but the initial binding occurs to a form which is sterically complementary
as we saw in the small inhibitors before.
This I skip and come to the next way of regulation, namely the fact that we find proteases which are explicitly specific.
One of them is thrombin itself.
And this is achieved by making a rather complicated and extended substrate binding surface.
This is thrombin with a small inhibitor bumped and you see this steep canyon which marks the substrate binding site
and you can imagine that it accepts only a rather specific amino acid sequence in there.
This has been used, discovered and used so to speak during evolution by blood sucking animals.
They live on liquid blood.
If it would coagulate, it would die.
So there is a strong evolutionary pleasure to develop a very efficient coagulation inhibitor system.
They do have actually extremely specific and powerful thrombin inhibitors.
What we looked at was at these various complexes of thrombin in blue
and the various portent thrombin inhibitors here in the leech, here in a blood sucking bug and here in the tick.
These green or brown or purple molecules perfectly fit into the substrate binding site that we saw before,
but using very different scaffolds.
So nature plays around and makes it perfect.
This is another way of generating specificity, another example, namely almost solely electrostatic complementarity
that we find in the proprotein convertases, the name of this specific one, the most important one in mammalian species is furin.
It is an enzyme which is required to activate hormones, cell surface receptors and other proteins
by cleaving at the polybasic site.
Again this physiological process is misused by pathogens.
These pathogens, you find quite prominent names in the list of bacterial or viral pathogens,
need the action of furin to become virulent.
They need proteolytic cleavage at their coat proteins or to activate anthrax toxin for instance.
Again at a polybasic site.
You can imagine, there is a lot of interest from the pharma side in developing furin as a target, as a drug target.
But there is the other side of the coin, namely the enormous physiological relevance of these ….
I come back to that later.
How is specificity achieved?
This is the molecule ….
The substrate binds up here.
The specificity is achieved by generating a highly acidic binding site, not surprising.
So that it is full of glutamates and aspartates to make the binding site for this oligo-lysine arginine inhibitor.
So a specificity mainly through electrostatics.
This was the only publication so far we were able to place in “bild”, simply because of the importance of this.
Now proenzyme cleavage.
Most of the proteases are synthesised as proenzymes and there are two ways to activate them.
In both ways there is limited proteolysis.
Of a part it folds away and this process may involve or may not involve a conformational change.
Here not and here a conformational change and there are examples of both.
So the simplest one we saw in procarboxypeptidase.
Again we can compare the classical carboxypeptidase structure with the procarboxypeptidase structure, find no structural change.
This is the active site, marked by the sink.
So the pro-part folds away after limited proteolysis cleavage and then simply exposes the substrate binding site, very simple.
This is a variation of the same scheme.
This is kumamolysin, is a protease from a very thermophilic bacterium.
This is the enzyme part, this is the pro-part.
It shows a very extended linking region which follows the substrate binding site.
But not exactly.
So it is not cleaved or it is only cleaved after a signal which is probably temperature increase to rearrange slightly
so that the active sites can work on it and then the pro-part folds away and the substrate binding site becomes free.
Again no structural change in the enzyme part when we compare the active enzyme with the proenzyme.
Let me go back.
This is the proenzyme cleavage….
And this is the … of the serine protein… thrombin, chymotrypsin.
So the biochemical basis of this had been studied very early by Hans Neurath and Earl Davie in Seattle.
They found that a zymogen is cleaved at a specific peptide point which has a sequence arginine, isoleucine
and then this short peptide, the pro-part folds away and the enzyme then becomes active.
So this was the biochemical evidence.
Now we looked at the structures.
This is a more modern version of it with the example thrombin.
But what happens here is exactly the same throughout the trypsin-like serine protease family.
So we have the inactive precursor with the closed loop, specific cleavage
and then the insertion of this new N-terminus here in the middle of the molecule and a substantial rearrangement of the surface.
So the triggering event of this surface rearrangement is the formation of an internal sort linkage.
So as I said this is the classical trypsin activation mechanism.
I come back to that in a different context later.
Another way to regulate or to limit proteolytic action is by colocalisation.
This we find for instance in all of the blood clotting factors of the coagulation cascade.
The structures look like this, this is factor 10, one of the early factors in clotting.
There is an enzyme part, its structure belongs to the trypsin family.
There are linker domains and there is a membrane anchor.
In this way the reaction is limited to two dimensions to the vessel surface.
This is where it should happen.
Another way of regulating which we found in two versions, protease activity namely by cofactor binding,
there are systems where the cofactor, a small or larger protein fundamentally changes the specificity,
the activity of an enzyme, against its substrate.
There are again two principle ways to do that, namely the cofactor binding
just offers a new interaction site with the substrate so that it is bound stronger, it’s bound productively.
Or the other way, that the cofactor causes an allosteric change in the enzyme
and only this change conformation is able to bind substrate.
And we find both.
The first one is a beautiful example of the consequences of these membrane anchors of coagulation enzymes.
This is thrombin which is peripherally bound to the membrane via a Gla domain.
And there is protein C which is one of the regulatory components in the coagulation cascade.
Now, protein C when activated shuts down coagulation.
And it is activated by thrombin.
So thrombin in this case has anti-coagulatory properties,
while of course thrombin we usually associate with its coagulatory properties.
But in that way by activating protein C shuts coagulation down.
Now, what protein C does when it is activated, it simply degrades all the upstream coagulation factors.
Protein C and thrombin do not care about each other at all,
except when there is a third component around which is called thrombomodulin for obvious reasons.
This is again a crystallographic study.
Now we know that it is these three domains of the multidomain thrombomodulin
which are responsible for making a productive thrombin, thrombomodulin complex,
productive in the sense that it is able to activate protein C.
So this is the binary complex of thrombin with the three domains of thrombomodulin.
And this is the ternary complex thrombin, thrombomodulin and protein C which is bound in exactly the way
and the orientation that its susceptible peptide bond, which has to be cleaved for activation
comes to lie at the active site of thrombin.
What you see here is that a very large interacting surface between the thrombomodulin and protein C is made.
And only if that is available, so only the binary complex is able to bind protein C.
Without thrombomodulin the affinity of protein C to thrombin is too low to be productively bound.
As we have also the structures of the individual components we can say there is no conformational change.
So the cofactor just increases the interaction sites.
But there is another way.
And I am back now again with the serine proteases and their activation which I told you already about,
the triggering event of the internal sort bridge and the rearrangement.
There are staphylococci which are quite dangerous bacteria when in circulation, actually lethal in circulation.
They misuse this physiological process and they have a virulence factor which is called staphylocoagulase
which interacts with the inactive pro-form of thrombin and activates it to an activity like active thrombin without this,
what we thought obligatory proteolytic step that I showed before.
This is staphylocoagulase and all alpha-helical protein.
It embraces the prothrombin.
It has an N-terminus with exactly the same sequence that we find in active thrombin.
It sticks it exactly into the binding site where inactive thrombin, the N-terminus is located.
So staphylocoagulase is a cofactor, induces conformational change by simulating the physiological activation mechanism
and activates prothrombin in this case.
This is an example where the substrate may act as an activator itself.
This is some recent work which we did on tryptase, again a quite interesting drug target for some lung diseases.
It has trypsin-like subunits but it forms a tetramer, the active sites are located inside, here.
In that way by tetramerization the access to the substrate binding site is restricted.
You find that principle then in the proteasome to which I will come in a minute.
Tryptase physiologically occurs in two forms:
A beta-tryptase which is active.
Here, by the way, are the active site residues, the serine and histidine and aspartate and this is the substrate docking site.
This is where substrate has to align in order to be productively positioned relative to the serine-histidine diet.
The other form is alpha-tryptase which is inactive.
It’s very, very similar.
The sequence identity is more than 90% but there is a conspicuous sequence change, namely …
Ich freue mich, Ihnen den nächsten Redner vorzustellen,
Herrn Professor Robert Huber vom Max-Planck-Institut für Biochemie in Martinsried.
Er erhielt 1988 zusammen mit Deisenhofer und Michel den Chemie-Nobelpreis
für “die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur eines photosynthetischen Reaktionszentrums”.
Das markierte auch die erste Kristallisations- und Strukturanalyse eines Membranproteins.
Ich erinnere mich noch an diese spannende Zeit, nicht nur wegen der Leute, die sich mit Photosynthese beschäftigten,
sondern wegen der Biochemie, Biophysik und medizinischen Forschung im Allgemeinen.
Professor Huber spricht heute über verwandte Themen:
die Proteolyse, ihre Regulation und molekulare Basis
Was Sie hier sehen, ist das Gesicht eines emeritierten Professors, der immer noch nicht gelernt hat nein zu sagen.
Ich freue mich sehr, in Lindau, dieser wunderschönen Stadt in meiner bayerischen Heimat, zu sein und Studenten zu treffen,
um ihnen mein Fachgebiet, die Proteinkristallographie, näherzubringen
und vielleicht sogar einige von ihnen davon zu überzeugen, sich mit diesem Gebiet näher zu beschäftigen.
Mein Vorredner, Herr Professor Blobel, hat mit seinem Vortrag, den ich mit großem Interesse verfolgt habe,
hervorragende Werbung für die Proteinkristallographie gemacht – daran möchte ich gerne anknüpfen.
Es handelt sich bei diesem Thema um ein relativ junges Forschungsgebiet,
dessen Vater der im englischen Cambridge tätige Max Perutz ist.
In den letzten 20 Jahren haben auf diesem Gebiet jedoch aufgrund der technischen und methodischen Entwicklungen,
die eigentlich aus ganz anderen Bereichen wie der Gentechnik, rekombinanten Proteinen, der Hochenergiephysik,
dem Computerwesen und der graphischen Datenverarbeitung stammen, große Veränderungen stattgefunden.
Ich werde nicht über die Proteinkristallographie referieren,
sondern möchte die Ergebnisse und biologischen Auswirkungen dieser hochauflösenden Proteinstrukturen für sich sprechen lassen,
wie Sie das in Herrn Blobels Vortrag bereits so schön gesehen haben.
Ich habe als System die Proteasen gewählt – damit beschäftigte ich mich seit Ende der 60er Jahre.
Natürlich habe ich während meiner Laufbahn auch zahlreiche andere Themen verfolgt und mit anderen Systemen gearbeitet –
am bekanntesten sind wohl die Proteine der Photosynthese,
für die ich 1988 zusammen mit Hartmut Michel und meinem damaligen Doktoranden Johann Deisenhofer den Nobelpreis erhalten habe.
Doch zurück zu den Proteasen.
Eine ganz einfache chemische Reaktion, die Hydrolyse einer Peptidbindung.
Dafür ist, wie Sie wissen, eine heiße Säure oder Base notwendig, doch in der Natur gibt es Enzyme,
und zwar überraschenderweise viele.
Etwa 3% aller Gene in der Tier- und Pflanzenwelt sowie in Bakterien kodieren Proteinasen.
Abgesehen von der Anzahl der existierenden Proteasen sind vor allem ihre vielfältigen Strukturen und Mechanismen einzigartig.
Für gewöhnlich werden sie nach dem Hauptnukleophil eingeteilt – Serin, Threonin, Metalloproteinasen.
Doch auch innerhalb dieser Gruppen gibt es Unterschiede.
Klassisch ist das gemeinsame Prinzip, der gemeinsame Mechanismus der trypsin-artigen Proteasefamilie
und der subtilisin-artigen Proteasefamilie – Proteasen, die keinerlei Bezug zueinander haben,
aber derselben Proteolyse, demselben Proteolysemechanismus unterliegen.
Nun, der Grund für diese Fülle und Vielfalt der Proteasen liegt in ihrer Beteiligung an physiologischen Prozessen.
Einen solchen Prozess zeige ich Ihnen hier.
Es handelt sich um die Blutgerinnungskaskade,
die über eine Reihe von Aktivierungsschritten mit begrenzter proteolytischer Aktivität von der Wunde bis zum Thrombus führt.
Natürlich ist dieser Prozess stark reguliert.
Es gibt Inhibitoren und Komponenten, die ihnen entgegenwirken.
Auf eine von ihnen, das Protein C, werde ich später noch zurückkommen.
Nun, die letzte Komponente, diejenige, die durch Spaltung von Fibrinogen den Thrombus bildet, heißt Faktor II oder Thrombin.
Ich werde sie im Laufe meines Vortrags immer wieder als Beispiel verwenden.
Die Vielfalt, die uns bei den Proteasen begegnet, liegt also darin begründet,
dass die begrenzte Proteolyse einen wichtigen physiologischen Regulationsmechanismus darstellt.
Diese Vielfalt der proteolytischen Strukturen und Mechanismen
korreliert mit den zahlreichen Möglichkeiten zur Regulation der proteolytischen Aktivität.
Das ist das Thema meines Vortrags heute Morgen.
In diesem Schema habe ich versucht, die verschiedenen Grundprinzipien der Regulation der Protease-Aktivität zu kategorisieren.
Ich werde sie nacheinander durchgehen und Ihnen jeweils Beispiele geben.
Ich beginne mit der einfachsten Regulation, nämlich der Inhibition einer Protease durch ein Protein,
das zu der Substratbindungsstelle sterisch komplementär ist.
Es handelt sich, wie wir festgestellt haben, um das erste Beispiel aus den späten 60er, frühen 70er Jahren.
Hier sehen Sie Trypsin in einem Komplex mit dem basischen pankreatischen Trypsin-Inhibitor.
Wir untersuchten nicht nur den Komplex als solchen, sondern auch die einzelnen Komponenten, und stellten fest,
dass es bei der Kombination der beiden Komponenten außer geringfügigen Bewegungen in peripheren Seitenketten
nicht zu Strukturveränderungen kam, sondern eine bereits ausgebildete strukturelle Komplementarität bestand.
Später befassten wir uns mit anderen Proteaseklassen.
Das hier ist die Serinprotease-Klasse, hier haben wir die trypsin-artigen Proteinasen,
hier die papain-artigen und hier die Metalloproteasen.
Wir stoßen immer wieder auf dieses Prinzip – eine bereits ausgebildete sterische Komplementarität, keine Strukturveränderung.
Das Ausmaß, in dem der Inhibitor das Substrat imitiert, sich wie das Substrat bindet, variiert allerdings.
Hier haben wir den Fall der Serinprotease.
Bei der Cysteinprotease ist nur ein Teil der Substratbindungsstelle von einem Inhibitorsegment belegt.
Bei den Metalloproteasen finden sehr umfängliche, so genannte exozytäre Wechselwirkungen statt.
Die Inhibitoren – TIMP – sind wesentlich größer als die Protease, die sie inhibieren,
sie hüllen sie, wenn man so will, beinahe ein.
Daher sind für eine starke und spezifische Wechselwirkung beträchtliche exozytäre Interaktionen notwendig.
Die Überraschung kam in den 80er Jahren, als wir uns mit den Inhibitoren der Serinproteasen in unserem Blut beschäftigten,
die z.B. vor unerwünschter Gerinnung und vielen anderen Prozessen schützen.
Es handelt sich dabei um sehr große Serinproteinase-Inhibitoren, die die unterschiedlichste Form aufweisen.
Sie können in aktiver Form mit komplementärer Bindungsoberfläche,
d.h. komplementär zu der Substratbindungsstelle der Protease, oder in latenter Form, d.h. als Isomer auftreten.
Chemisch vollkommen identisch ist die Schleifenstruktur hier jedoch teilweise in das Beta-Faltblatt eingefügt.
Sie liegen in gespaltener Form vor, d.h. nachdem sie ihre Arbeit erledigt haben, werden sie von der Protease gespalten
und ordnen sich in einer Weise neu an, dass sich dieses rote Segment in das Beta-Faltblatt einfügt und die Komplexform entsteht.
Die Protease interagiert zunächst hier oben, spaltet dann die empfängliche Peptidbindung des Inhibitors
und ordnet sich auf der anderen Seite neu an.
Das Schema ist noch sehr viel komplexer, doch die anfängliche Bindung wird mit einer sterisch komplementären Form,
wie wir sie zuvor bei den kleinen Inhibitoren kennengelernt haben, eingegangen.
Das hier überspringe ich und komme zur nächsten Regulationsmöglichkeit, nämlich der Tatsache,
dass es Proteasen gibt, die absolut spezifisch sind.
Eine davon ist Thrombin selbst.
Erreicht wird diese Spezifität durch eine relativ komplizierte und ausgedehnte Substratbindungsoberfläche.
Das hier ist Thrombin mit einem eingeschobenen kleinen Inhibitor;
Sie sehen hier diese tiefe Schlucht, die die Substratbindungsstelle markiert.
Sie können sich vorstellen, dass hier nur eine sehr spezifische Aminosäuresequenz akzeptiert wird.
Dies wurde im Laufe der Evolution von blutsaugenden Tieren entdeckt und genutzt.
Diese Tiere leben von flüssigem Blut; wenn es gerinnt, sterben sie.
Die Entwicklung eines effizienten Systems zur Gerinnungshemmung stellt also einen großen evolutionären Vorteil dar.
Die Tiere verfügen in der Tat über äußerst spezifische und leistungsfähige Thrombin-Inhibitoren.
Wir befassten uns mit den verschiedenen, hier blau dargestellten Thrombin-Komplexen
und den unterschiedlichen wirksamen Thrombin-Inhibitoren in Blutegeln, blutsaugenden Insekten und Zecken.
Diese grünen, braunen oder violetten Moleküle passen perfekt in die Substratbindungsstelle,
die wir zuvor gesehen haben, benutzen jedoch ganz unterschiedliche Gerüste.
Die Natur spielt also herum und sorgt für Perfektion.
Spezifität lässt sich aber auch anders erzeugen.
Es gibt beispielsweise eine fast ausschließlich elektrostatische Komplementarität, die wir in den Proproteinkonvertasen finden.
Die wichtigste Proproteinkonvertase bei Säugetieren heißt Furin.
Es handelt sich dabei um ein Enzym, das notwendig ist, um Hormone, Zelloberflächenrezeptoren
und andere Proteine durch Spaltung an der polybasischen Spaltstelle zu aktivieren.
Auch dieser physiologische Prozess wird von Erregern zweckentfremdet.
Diese Erreger – es finden sich recht prominente Namen in der Liste der Bakterien und Viren –
sind auf die Wirkung von Furin angewiesen, damit sie virulent werden können.
Sie brauchen die proteolytische Spaltung ihrer Hüllproteine, um beispielsweise das Toxin Anthrax zu aktivieren.
Auch hier haben wir also eine polybasische Spaltstelle.
Wie Sie sich vorstellen können,
besteht seitens der Pharmaindustrie großes Interesse an der Entwicklung von Furin als therapeutischem Target.
Die Rückseite der Medaille ist jedoch die enorme physiologische Relevanz dieser ….
ich komme später noch einmal darauf zurück.
Wie wird nun die Spezifität erreicht?
Das hier ist das Molekül, das Substrat bindet sich an dieser Stelle daran.
Die Spezifität wird erzielt, indem, was nicht überraschend ist, eine stark saure Bindungsstelle erzeugt wird.
Dort befinden sich zahlreiche Glutamate und Aspartate, die die Bindungsstelle für den Oligo-Lysin-Arginin-Inhibitor bilden.
Das heißt Spezifität hauptsächlich durch Elektrostatik.
Das war die bisher einzige Publikation, mit der wir in die Bildzeitung gekommen sind, weil sie eben von solcher Bedeutung ist.
Doch nun zur Proenzymspaltung.
Die meisten Proteasen werden als Proenzyme synthetisiert, und es gibt zwei Wege sie zu aktivieren.
In beiden Fällen findet eine begrenzte Proteolyse statt.
Einmal wird ein Teil weggeklappt – bei diesem Prozess kann sich die Konformation verändern, muss es aber nicht.
Hier haben wir keine Konformationsveränderung, hier haben wir eine, hier sind Beispiele für beides.
Das einfachste Beispiel haben wir bei der Procarboxypeptidase gesehen.
Auch hier können wir die klassische Carboxypeptidase-Struktur mit der Procarboxypeptidase-Struktur vergleichen
und finden keine Strukturveränderung.
Das ist die aktive Stelle, markiert durch eine Vertiefung.
Der Pro-Teil klappt nach der begrenzten proteolytischen Spaltung weg und legt damit ganz einfach die Substratbindungsstelle frei.
Dies hier ist eine Variation desselben Schemas.
Es handelt sich um Kumamolysin, eine Protease aus einem stark thermophilen Bakterium.
Das ist der Enzym-Teil, das der Pro-Teil.
Es zeigt sich eine sehr ausgedehnte Bindungsregion, die der Substratbindungsstelle folgt, allerdings nicht genau.
Sie wird nicht oder erst nach einem Signal, wahrscheinlich einem Temperaturanstieg, gespalten,
um sich geringfügig neu anzuordnen, so dass die aktiven Stellen sie bearbeiten können.
Im Anschluss daran klappt der Pro-Teil weg und die Substratbindungsstelle liegt frei.
Bei Vergleich des aktiven Enzyms mit dem Proenzym kommt es auch hier nicht zu einer strukturellen Veränderung des Enzym-Teils.
Lassen Sie mich noch einmal zurückgehen.
Das ist die Proenzymspaltung und das ist das Serinprotein, Thrombin, Chymotrypsin.
Die biochemischen Grundlagen wurden bereits sehr früh von Hans Neurath und Earl Davie in Seattle untersucht.
Sie stellten fest, dass ein Zymogen an einer spezifischen Peptidstelle mit der Sequenz Arginin, Isoleucin
und dann diesem kurzen Peptid gespalten wird, der Pro-Teil wegklappt und das Enzym so aktiviert wird.
Das war der biochemische Nachweis.
Jetzt schauen wir uns die Strukturen an.
Das ist eine modernere Version mit Thrombin als Beispiel.
Doch was hier passiert, ist genau dasselbe wie bei der gesamten Familie der trypsin-artigen Serinproteasen.
Wir haben die inaktive Vorstufe mit der geschlossenen Schleife, eine spezifische Spaltung
und dann den Einschub dieses neuen N-Terminus hier in der Mitte des Moleküls
und damit eine beträchtliche Umgestaltung der Oberfläche.
Der Auslöser dieser Oberflächenumgestaltung ist die Bildung einer Art internen Bindung.
Wie ich bereits sagte, ist dies der klassische Trypsinaktivierungsmechanismus.
Ich werde später in einem anderen Kontext noch mal einmal darauf zurückkommen.
Eine andere Möglichkeit zur Regulierung oder Begrenzung der proteolytischen Wirkung ist die Kolokalisierung.
Diese findet sich z.B. in sämtlichen Blutgerinnungsfaktoren der Gerinnungskaskade.
Die Strukturen sehen wie diese hier aus – das ist Faktor 10, einer der frühen Faktoren bei der Gerinnung.
Er besitzt einen Enzym-Teil, und von seiner Struktur her gehört er zu Trypsinfamilie.
Zudem weist er Linker-Domänen und einen Membrananker auf.
Auf diese Weise wird die Reaktion zweidimensional auf die Gefäßoberfläche, wo das Geschehen stattfinden soll, begrenzt.
Eine weitere Regulationsmöglichkeit der Protease-Aktivität, die in zwei Versionen vorkommt, ist die Cofaktorbindung.
Es gibt Systeme, bei denen ein Cofaktor, ein kleines oder größeres Protein,
die Spezifität bzw. Aktivität eines Enzyms bezüglich seines Substrats grundlegend verändert.
Dies kann grundsätzlich auf zweierlei Art und Weise erfolgen:
Einmal offeriert die Cofaktorbindung einfach eine neue Interaktionsstelle mit dem Substrat,
so dass die Bindung stärker und wirksamer ist.
Das andere Mal bewirkt der Cofaktor eine allosterische Veränderung des Enzyms,
und nur diese Konformationsänderung kann sich an das Substrat binden.
Uns begegnen beide Varianten.
Die erste Variante ist ein wunderbares Beispiel für die Folgen der Membrananker von Gerinnungsenzymen.
Das hier ist Thrombin, das über die Gla-Domäne peripher an die Membran gebunden ist.
Hier ist das Protein C, eine der Regulierungskomponenten der Gerinnungskaskade.
Protein C beendet die Gerinnung, wenn es aktiviert wird.
Die Aktivierung erfolgt durch Thrombin.
Thrombin hat also in diesem Fall gerinnungshemmende Eigenschaften,
während wir es für gewöhnlich mit gerinnungsfördernden Eigenschaften verbinden.
Durch die Protein C-Aktivierung blockiert es jedoch die Gerinnung.
Was tut nun das Protein C, wenn es aktiviert wird?
Ganz einfach, es baut alle vorgeschalteten Gerinnungsfaktoren ab.
Protein C und Thrombin haben überhaupt nur dann etwas miteinander zu tun, wenn eine dritte Komponente hinzukommt,
die aus offensichtlichen Gründen als Thrombomodulin bezeichnet wird.
Hier haben wir wieder eine kristallographische Studie.
Nun, wir wissen, dass es diese drei Domänen des Mehrdomänen-Thrombomodulins sind,
die für die Entstehung eines wirksamen Thrombins, des Thrombomodulin-Komplexes, verantwortlich sind –
wirksam in dem Sinne, dass Protein C aktiviert werden kann.
Das hier ist der binäre Komplex aus Thrombin und den drei Thrombomodulin-Domänen.
Und das ist der ternäre Komplex aus Thrombin, Thrombomodulin und Protein C,
der sich exakt ausgerichtet an sein empfängliches Peptid bindet,
das zwecks Aktivierung gespalten werden und an der aktiven Stelle des Thrombins zu liegen kommen muss.
Was Sie hier sehen, ist, dass zwischen Thrombomodulin und Protein C eine sehr große Interaktionsfläche entsteht.
Nur wenn diese Fläche vorhanden ist, kann sich der binäre Komplex an das Protein C binden.
Ohne Thrombomodulin ist die Affinität von Protein C zu Thrombin für eine wirksame Bindung zu gering.
Da wir auch die Strukturen der einzelnen Komponenten kennen, können wir sagen, dass keine Konformationsänderung stattfindet.
Der Cofaktor vergrößert also lediglich die Interaktionsflächen.
Es gibt aber noch eine andere Möglichkeit.
Jetzt bin ich wieder bei den Serinproteasen und ihrer Aktivierung, die ich Ihnen bereits erläutert habe;
Auslöser sind hier eine Art interne Brücke sowie die Neuanordnung.
Es gibt Staphylokokken, die, wenn sie in den Blutkreislauf gelangen, ziemlich gefährlich, de facto sogar tödlich sein können.
Sie zweckentfremden diesen physiologischen Prozess und verfügen über einen Virulenzfaktor, die so genannte Staphylocoagulase,
die mit der inaktiven Vorform des Thrombins interagiert und sie in einer Weise aktiviert,
dass ihre Aktivität der von aktivem Thrombin entspricht,
ohne dass der unserer bisherigen Meinung nach obligatorische proteolytische Schritt, den ich Ihnen zuvor gezeigt habe, erfolgt.
Das sind die Staphylocoagulase und ein alpha-helikales Protein; sie umschließt das Prothrombin.
Sie weist einen N-Terminus mit genau derselben Sequenz, wie wir sie beim aktiven Thrombin finden, auf
und heftet sich exakt dort an die Bindungsstelle, wo sich das inaktive Thrombin, der N-Terminus befindet.
Die Staphylocoagulase ist also ein Cofaktor,
der durch Simulation des physiologischen Aktivierungsmechanismus eine Konformationsänderung bewirkt
und in diesem Fall das Prothrombin aktiviert.
In diesem Beispiel kann das Substrat selbst als Aktivator fungieren.
Hierbei handelt es sich um kürzlich von uns durchgeführte Untersuchungen zu Tryptase,
ebenfalls einem sehr interessanten therapeutischen Target für bestimmte Lungenerkrankungen.
Sie verfügt über trypsin-artige Untereinheiten, bildet aber ein Tetramer, und die aktiven Stellen befinden sich hier drinnen.
Durch die Tetramerisierung wird der Zugang zu der Substratbindungsstelle beschränkt.
Dieses Prinzip findet sich auch beim Proteasom; ich werde ich einer Minute darauf zurückkommen.
Tryptase tritt physiologisch in zwei Formen auf.
Als Beta-Tryptase, dann ist sie aktiv.
Hier sehen Sie übrigens die Reste an der aktiven Stelle, Serin, Histidin und Aspartat,
und das hier ist die Andockstelle des Substrats.
Hierhin muss sich das Substrat ausrichten, damit es bezüglich Serin-Histidin wirksam positioniert ist.
Die andere Form ist die inaktive Alpha-Tryptase.
Sie ist sehr, sehr ähnlich.
Zwar stimmen die Sequenzen zu mehr als 90% überein, doch eine Sequenzänderung ist auffallend, nämlich…
