Robert Holley

Vielen Dank, Graf Bernadotte, meine verehrten Gäste, meine Damen und Herren. Wir möchten verstehen, wie das Wachstum von Säugetierzellen gesteuert wird. Wir würden z.B. gerne wissen, wie die Steuerung der Wundheilung funktioniert. Wie kommt es, dass sich die Zellen in der Nähe der Wunde teilen und die Wunde verschließen? Sobald die Wunde repariert ist, hören sie auf zu wachsen. Wir möchten auch gerne die Regeneration der Leber und die Nierenhypertrophie verstehen. Entfernt man bei einem Tier den Großteil der Leber, beginnen sich die verbleibenden Leberzellen zu teilen, so dass innerhalb von ein paar Tagen die ursprüngliche Lebermasse neu entsteht. Entfernt man eine Niere, wächst die andere so lange weiter, bis sie praktisch das Gewicht von zwei Nieren erreicht hat. Diese normalen Wachstumsvorgänge möchten wir gerne verstehen. Was veranlasst Zellen dazu zu wachsen und das Wachstum wieder einzustellen, wenn sie nicht weiter wachsen sollen? Außerdem würden wir auch gerne die pathologischen Wachstumsvorgänge verstehen, wie sie z.B. bei Krebs oder der Sklerose auftreten. Was ist in der Krebszelle schief gegangen, dass sie sich im Gegensatz zu einer normalen Zelle immer weiter teilt? Wir hoffen natürlich, dass wir, wenn wir die normalen Wachstumsvorgänge gut genug verstehen, das Wachstum außer Kontrolle geratener Zellen, z.B. Krebszellen regulieren können. Dies sind also die Fragen, die sich stellen. Wie lassen sie sich untersuchen? Man weiß seit einigen Jahren, dass sich Säugetierzellen im Labor kultivieren lassen. In diesen Zellkulturen wird seit kurzem beobachtet, dass Zellpaare bestehend aus einer normalen Zelle und einer Tumorzelle häufig unterschiedlich wachsen. Die normale Zelle zeigt ein kontrolliertes Wachstum, die Tumorzelle dagegen wächst unkontrolliert. Das erste Dia zeigt ein Beispiel hierfür. Die Zellen auf der linken Seite sind normale Zellen, eine sogenannte 3T3-Zelllinie aus einem Mausembryo. Sie wachsen, bis der Boden der Petrischale, in der sie kultiviert werden, bedeckt ist, dann hören sie auf zu wachsen. Die Zellen auf der rechten Seite sind SV40-transformierte 3T3-Zellen. Sie wachsen immer weiter, türmen sich auf und wachsen übereinander. Das bei diesen beiden Zelltypen beobachtete Wachstum unterscheidet sich deutlich. Die Erklärung hierfür ist simpel: Eine der Zellen ist mit dem SV40-Virus infiziert und transformiert worden. Das ist ein Beispiel; es gibt andere, bei denen man den Unterschied zwischen einer normalen und einer pathologischen Zelle im Labor vergleichen kann. Man würde zunächst fragen, was das Wachstum der normalen Zelle steuert, also der Zelle, die im Labor eine Wachstumssteuerung aufweist. zur Menge des dem ursprünglichen Medium zugesetzten Kälberserums proportional ist. Die virus-transformierte Zelle, die SV 3T3-Zelle, wächst in sehr hoher Dichte und bei sehr geringer Serumkonzentration. Sie stellt das Wachstum nicht ein, sondern wächst weiter, nur langsamer als bei höherer Serumkonzentration. In diesem Fall ist also klar, dass die Wachstumssteuerung der 3T3-Zelle vom Serum abhängt. Jetzt fragt man sich, was im Serum das Wachstum der 3T3-Zelle steuert. Wir benötigen einen Test, eine Möglichkeit, den Grad der Wirksamkeit in einer Serumfraktion zu messen. Man spricht normalerweise vom Zellzyklus, bei dem sich Zellen während der Mitose teilen. Die Tochterzellen durchlaufen vor Auslösung der DNA-Synthese die G1-Phase (Gap 1). Anschließend initiieren sie die DNA-Synthese (S-Phase). Nach Abschluss der DNA-Synthese durchlaufen sie die G2-Phase, bevor sie sich teilen. Zellen im Ruhezustand befinden sich im Allgemeinen in der G1-Phase bzw. in der üblicherweise als G0-Phase / frühe G1-Phase bezeichneten Phase. Setzen wir einer im Ruhezustand befindlichen Population Serum zu, lässt sich ein Wachstum auslösen. Nach einigen Stunden kommt es zur Einleitung der DNA-Synthese. Ein einfacher Test auf einen Faktor zur Wachstumsstimulation besteht darin, radioaktives Symadin zuzusetzen und zu beobachten, ob eine DNA-Synthese erfolgt. Das nächste Dia stellt die Ergebnisse eines solchen Experiments dar (bitte das nächste Dia). Die im Ruhezustand befindlichen Zellen verbleiben im Wesentlichen auf unbestimmte Zeit in diesem Zustand; setzt man jedoch zum Zeitpunkt Null Serum zu, regen sie nach zehn, zwölf Stunden eine DNA-Synthese an. Dies lässt sich gut mittels Autoradiographie messen; dabei wird ein Film auf die dickflüssigen Zellen aufgelegt. Alternativ wird die DNA einfach isoliert und mittels eines Szintillationszählers ausgezählt, was das übliche Verfahren ist. Setzt man statt einer großen eine kleine Menge Serum zu, sieht man, dass die Einleitung der DNA-Synthese zur selben Zeit, d.h. mit einer Verzögerung von zehn, zwölf Stunden, stattfindet. Die Anzahl der Zellen, die die DNA-Synthese auslösen, ist jedoch geringer, und es würde viele Stunden dauern, bis alle Zellen das Wachstum angeregt hätten. Verwendet man ein Assay wie dieses, kann man Serum fraktionieren und fragen, was in diesem Serum zur Stimulation des Wachstums normaler Zellen führt. Auf dem nächsten Dia sehen Sie, dass im Falle eines fraktionierten Serums zahlreiche Fraktionen vorliegen und die Fraktionskombinationen eine bessere Wirksamkeit aufweisen als einzelne Fraktionen. Es hat sich herausgestellt, dass für die Serumrekonstruktion mehrere Dinge kombiniert werden müssen. Diese Abkürzungen beziehen sich auf den Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), Insulin (INS) und Dexamethason (DX). Man kann auch Hydrocortison verwenden. Die Schlussfolgerung aus diesen vor rund zehn Jahren durchgeführten Fraktionierungstests lautet: Das Wachstum von Säugetierzellen in Kulturen wird durch eine Kombination von hormonähnlichen Substanzen stimuliert: Polypeptidhormone und andere, mit Polypeptidhormonen vergleichbare, Hormone. Weiterhin stellt man beim Blick in andere Bereiche fest, dass es neben den Polypeptidhormonen noch zahlreiche andere Faktoren gibt, die das Wachstum der Kultur steuern. Ein Beispiel sehen Sie im nächsten Dia. Die alleinige Zugabe von Prostaglandin E1 - hier eine Arbeit aus dem Labor von Rosengurt - bewirkt so gut wie keine Stimulation der DNA-Synthese. Liegt jedoch ein wenig Insulin vor, wird die DNA-Synthese deutlich stimuliert. Mit dieser Stimulation korreliert ist eine Stimulation der cAMP-Konzentration in der Zelle; ich komme in einer Minute darauf zurück. Zusammengefasst lässt sich im nächsten Dia grundsätzlich sagen, dass die Wachstumssteuerung nicht einfach ein Ein/Aus-Schalter ist. Wir haben gesehen, dass Zellen langsam oder schnell wachsen können. Das ist wie bei einem Gaspedal; das Tempo kann variieren, die Zellen können extrem langsam oder sehr schnell wachsen. Wie ich bereits erwähnt habe, hat sich herausgestellt, dass eine Kombination von Faktoren oftmals wirksamer ist als ein einzelner Faktor. Bei den natürlichen Wachstumsvorgängen werden also wahrscheinlich verschiedene Faktoren in kleinsten Mengen kombiniert. Schaut man sich die biologischen Materialien an, stellt man fest, dass das Wachstum von vielen verschiedenen Faktoren stimuliert wird. Als nächstes stellt sich die Frage, wie sie das Wachstum der Zelle steuern. Wie im nächsten Dia dargestellt, sind die Wachstumsfaktoren.... hier sind einige davon aufgeführt, es gibt zahlreiche. Darüber hinaus wird das Wachstum von verschiedenen Nährstoffen beeinflusst. Dann gibt es Wachstumsinhibitoren; ich komme gleich darauf zurück. Form und Oberfläche der Zelle sind ebenfalls wichtig. Die Wachstumssteuerung ist sehr komplex. Das nächste Dia zeigt, wo die Wachstumsfaktoren ihre Wirkung ausüben. Sie binden sich auf der Zelle an bestimmte Oberflächenrezeptoren, genau wie die Polypeptidhormone. Hier erfolgt die Bindung von jodiertem radioaktivem Wachstumsfaktor, in diesem Fall epidermalem Wachstumsfaktor. Der Grad der Bindung und der Zeitverlauf hängen von der Zelldichte ab. Hier liegt eine geringe, hier eine hohe Zelldichte vor. Auch die Temperatur ist entscheidend: hier sind es 37 Grad, hier 0 Grad, hier 2 Grad. Das Dia zeigt, dass sich die spezifische Bindung eines Wachstumsfaktors an einen Rezeptor auf der Zelloberfläche messen lässt. Dies bedeutet, dass die Zelle spezielle Wachstumsfaktor-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche benötigt, damit der Wachstumsfaktor aktiv ist. Es muss also nicht nur der Wachstumsfaktor vorliegen, sondern auch ein Rezeptor auf der Zelloberfläche. Der im Anschluss an die Bindung des Wachstumsfaktors an den Rezeptor ablaufende Prozess ist sehr kompliziert. Im nächsten Dia sehen Sie, dass sich auf diese Weise die Anzahl der Rezeptoren bestimmen lässt; sie variiert mit der Zelldichte. Das nächste Dia zeigt, dass man analysieren kann, was sich auf der Zelloberfläche befindet, was sich in der Zelle befindet und abgebaut wird, was sich in der Zelle befindet und nicht abgebaut wird, und so weiter. Was geschieht also? Der Wachstumsfaktor bindet sich an die Zelloberfläche und wird gemeinsam mit dem Zelloberflächenrezeptor internalisiert. Dann wird er abgebaut und ausgeschieden. All dies geschieht innerhalb von Minuten. Der Zelloberflächenrezeptor erscheint erneut und mehr Wachstumsfaktor bindet sich daran. Dieser gesamte Vorgang der Bindung des Wachstumsfaktors, der Internalisierung, des Abbaus und der Bindung von weiterem Wachstumsfaktor erfolgt über zehn oder zwölf Stunden, bevor die Zellen die DNA-Synthese auslösen. Jetzt möchte man verstehen, was geschieht, nachdem sich der Wachstumsfaktor an den Zelloberflächenrezeptor gebunden hat. Was macht er? Was passiert in der Zelle, das zu ihrem Wachstum führt? Ich habe bereits erwähnt, dass die cAMP-Konzentration durch die Substanzen beeinflusst werden kann. Das ist ein Vorgang, der in der Zelle geschieht. Ein anderer ist im nächsten Dia dargestellt, die Proteinphosphorylierung, in diesem Fall bei EGF- und A431-Zellen (eine Arbeit von Tony Hunter et al.). Die Phosphorylierung von Tyrosin steigt in der ersten Minute dramatisch an. Bei Phosphotyrosin handelt es sich um eine seltene Phosphoaminosäure in Proteinen. Man würde daher erwarten, dass nach Einwirken des Wachstumsfaktors relativ wenige Proteine phosphoryliert sind. Ein weiterer Vorgang in der Zelle ist die Veränderung der Ionenströme; sie ist im nächsten Dia dargestellt. Es handelt sich um eine Arbeit aus dem Rosengurt-Labor. Unter Bedingungen, die Einfluss auf die Initiierung der DNA-Synthese haben, ist der Thymidineinbau ein Maß für die DNA-Synthese. Es zeigt sich, dass die interzelluläre Kaliumionenkonzentration stark mit der Anregung der DNA-Synthese korreliert; in diesem Fall wurde die interzelluläre Kaliumionenkonzentration durch eine Veränderung der extrazellulären Natriumkonzentration beeinflusst. Die Wirkung der Wachstumsfaktoren führt jedoch zu einer Stimulation der Natriumionenströme, so dass die interzelluläre Kaliumionenkonzentration durch die Wachstumsfaktoren erhöht werden kann. Die Belege für die Bedeutung der Ionenströme stammen unter anderem aus Arbeiten zu Wachstumsinhibitoren. Ich habe sie vorhin erwähnt. Im Verlauf der letzten Jahre haben wir einen Wachstumsfaktor untersucht, der von BSC1-Zellen hergestellt wird. Das nächste Dia stellt das Schema dar, nach dem wir das Material aus dem von den Zellen konditionierten Medium isoliert haben: Ultrafiltration mit Rückgewinnung aus dem Filter, Gelfiltration, schließlich Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Im nächsten Dia sehen Sie die Ergebnisse der Chromatographie; hier ist ein kleiner Proteinpeak, hier ein großer Aktivitätspeak. Das nächste Dia zeigt die Inhibitorbande unter nicht-reduzierenden Bedingungen bei der Gelfiltration, hier nach HPLC. Unter reduzierenden Bedingungen fällt das Molekulargewicht auf etwa die Hälfte, so dass dieses Material offensichtlich eine Kombination aus zwei Untereinheiten ist. Das nächste Dia stellt eine ungefähre Aminosäurezusammensetzung für dieses Material dar. Relevant ist, dass sie als Wachstumsinhibitor äußerst wirksam ist. Im nächsten Dia wird das Wachstum bei einer Konzentration von einem Nanogramm pro Milliliter auf BSC1-Zellen um ungefähr 50% inhibiert; bei einer anderen Zelle ist die Wirksamkeit sogar noch größer. Bitte das nächste Dia. Es gibt eine Lungenzelllinie vom Nerz (MIC), die sogar bei einer Konzentration von weniger als 1/10 Nanogramm pro Milliliter, d.h. einem Mikrogramm pro Liter stark inhibiert wird. Die Zusammensetzung ist als Wachstumsinhibitor äußerst wirksam, ebenso wie die Wachstumsfaktoren das Wachstum äußerst wirksam stimulieren. Dieses Material kann wie die Bremse in einem Auto eingesetzt werden, um dem Effekt des Gaspedals - des Wachstumsstimulators - entgegenzuwirken. Das nächste Dia, bitte. Können wir nochmal zurückgehen? Ich sollte noch anmerken, dass sich unter den inhibierten Zellen bestimmte Säugetiertumorzellen befinden und dieses Material zur Inhibition des Wachstums von Säugetiertumoren eingesetzt werden kann. Das nächste Dia, bitte. Ein in einer athymischen Nacktmaus wachsendes humanes Mammakarzinom lässt sich mit dem Material inhibieren. Das nächste Dia stellt dar, was ich zuvor bezüglich der Verwendung als Bremse sagen wollte: die Verlangsamung des Wachstums beim Einsatz eines Wachstumsfaktors zur Wachstumsstimulation. Man kann Wachstumsfaktoren und Wachstumsinhibitoren so gegeneinander ausspielen, dass sich eine Kombination daraus bilden lässt, die sich gegenseitig aufhebt, mit dem Ergebnis, dass sich das Wachstum der Zelle nicht verändert. Gary Toback - das nächste Dia, bitte - zeigte jüngst, dass dieser Wachstumsfaktor Natriumionenströme in die Zelle inhibiert. Das Wachstum von BSC1-Zellen lässt sich einfach durch Zugabe von überschüssigem Natriumchlorid zu dem Medium stimulieren. Unter den Bedingungen der Natriumionenzugabe lässt sich ein Anstieg der interzellulären Natriumkonzentration sowie ein Fließgleichgewicht, das erheblich über dem ursprünglichen liegt, beobachten. Bei Zugabe des Inhibitors sinkt die Natriumionenkonzentration in der Zelle nach zwei Stunden, dem Kontrollzeitpunkt für diese Platten. Das nächste Dia, bitte. Wie dieses Dia zeigt (nein, noch einmal zurück zu diesem hier)...hier sehen Sie die Stimulation durch Natriumionen. Sie erkennen, dass bereits 5 mM Natriumionen eine Wirkung haben. Hier werden der Kontrolle Natriumionen zugesetzt, hier der Inhibitor. Der Inhibitor reduziert das Zellwachstum, wenn keine oder wenig Natriumionen zugesetzt werden, doch schließlich überwinden die Natriumionen die Wirkung des Inhibitors. Das nächste Dia, bitte. Hier lässt sich die Natriumionenkonzentration in den Zellen erhöhen, die Kaliumionenkonzentration verändert sich dagegen nicht, so dass vermutlich der interzelluläre pH-Wert beeinflusst wird. Der Franzose Pouysségur zeigte kürzlich, dass der Natrium-Protonen-Antiporter in Zellen für deren Reaktion auf Wachstumsfaktoren entscheidend ist. Einfach ausgedrückt stimuliert ein Wachstumsfaktor die Aufnahme von Natriumionen in die Zellen, was zu einer Wasserstoffsezernierung führt, die wiederum den internen pH-Wert erhöht. Eine Erhöhung des internen pH-Werts um einige wenige Zehntel der pH-Einheit genügt bereits, um die Wirksamkeit zahlreicher unterschiedlicher Enzyme zu beeinflussen. Bei den Wachstumsfaktoren bzw. Wachstumsinhibitoren lässt sich jedenfalls eine Vielzahl unterschiedlicher interzellulärer Wirkungen beobachten. Wir möchten gerne wissen, in welcher Reihenfolge die Ereignisse von der Stimulation bzw. Inhibition bis zur Wirkung auf die DNA-Synthese genau ablaufen. Das nächste Dia möchte ich gerne auslassen, ich habe das bereits angekündigt. Das nächste Dia, bitte. Es sind de facto ganz unterschiedliche Modelle der Vorgänge in der Zelle vorstellbar. Die Leute denken oftmals - und viele der aktuellen Forschungsprojekte gehen ebenfalls davon aus - dass diese unterschiedlichen Wachstumsfaktoren jeweils einen Schritte innerhalb einer Reihe von Schritten, die zur Einleitung der DNA-Synthese führen, beeinflussen. Es ist aber auch ein anderes Modell denkbar. Meiner Ansicht nach beeinflussen zumindest einige der Faktoren zur Wachstumssteuerung wahrscheinlich eine Vielzahl interzellulärer Prozesse. Die Erhöhung des internen interzellulären pH-Werts beispielsweise hat Einfluss auf die Wirkung zahlreicher unterschiedlicher Enzyme. Diese Stimulation der allgemeinen zellulären Vorgänge - Energieerzeugung, RNA und Proteinsynthese in der Zelle - diese massive Veränderung der interzellulären Vorgänge führt zur Bildung des Initiators der DNA-Synthese. Diese Fragen müssen noch geklärt werden. Wir würden gerne den gesamten Prozess im Labor rekonstruieren können, doch da die Auslösung der DNA-Synthese zehn Stunden dauert, ist dieses Experiment wahrscheinlich recht komplex. Was lässt sich abschließend über Krebszellen sagen? Was läuft in diesen Zellen schief? Das nächste Dia, bitte. Hier sehen Sie einige der Stellen, an denen es zu einer Veränderung der Wachstumssteuerung kommen kann. Wir haben festgestellt, dass dort Wachstumsfaktoren vorliegen. Die Produktion zusätzlicher Wachstumsfaktoren würde also das Wachstum stimulieren. Damit sie aktiv sind, müssen Rezeptorstellen vorliegen. Erhöht die Zelle die Zahl dieser Rezeptorstellen oder erzeugt Rezeptorstellen, über die sie normalerweise nicht verfügt, hat dies Einfluss auf ihr Wachstum. Eine Veränderung der Membranströme kann das Wachstum eindeutig beeinflussen. Auch die dauerhafte Veränderung der Proteinphosphorylierung kann Einfluss auf das Wachstum haben, ebenso wie eine Vielzahl von Stoffwechselveränderungen, also Modifizierungen der Enzyme, die den allgemeinen Stoffwechsel der Zelle verändern. Und natürlich Veränderungen der Genregulation. Eine Diskussion der Wachstumssteuerung wäre heutzutage nicht vollständig, würde man nicht wenigstens die Onkogene und Protoonkogene erwähnen. Kann ich bitte das nächste Dia haben? Ich bin mir sicher, Sie werden noch nähere Einzelheiten zu den Onkogenen hören, soweit ich weiß am Mittwoch. Eines der Onkogene, die bei Einschleusung in Zellen deren Wachstum fördern, ist jedoch wahrscheinlich mit einem Wachstumsfaktor namens PDGF (platelet-derived growth factor) verwandt. Es existiert also ein Beispiel für eine entsprechende Verwandtschaft. Das RB-Onkogen ist wahrscheinlich mit der Rezeptorstelle des epidermalen Wachstumsfaktors EGF verwandt. Das Sarkom-Onkogen hängt mit der Proteinphosphorylierung zusammen, die MIC mit genregulatorischen Veränderungen. Die Bereiche Wachstumssteuerung und Onkogene beginnen also ineinanderzugreifen. Kann ich bitte Licht haben? Zusammengefasst ist das grobe Bild der Wachstumssteuerung heute recht klar. Es existiert eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren und Wirkungsorte. Es sind aber noch viele Einzelheiten zu klären; das Bild ist natürlich sehr kompliziert. Die gute Nachricht ist, dass wir die Vorgänge allmählich verstehen, die schlechte, dass wir immer noch nicht viel gegen Krebs tun können. Was genau in vivo geschieht, ist immer noch größtenteils ungeklärt. Wir wissen fast nichts über die eigentliche Rolle der Wachstumsfaktoren und Wachstumsinhibitoren in vivo. Wir gehen davon aus, dass es Überraschungen geben wird. Daher zeichnen wir auch hier erst einmal ein ganz einfaches Bild von der Wachstumssteuerung. Ich nehme aber an, dass es Überraschungen geben und sich die Angelegenheit als sehr kompliziert erweisen wird. Vielen Dank.

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The Nobel Laureates invited to the Lindau meetings typically belong to one of two categories. Those in the first category fall in love with the idea of mixing with students, young scientists and other Nobel Laureates. They usually return over and over again. Those in the second category feel a bit uncomfortable and usually only participate once or twice. For some reason not known to me, Robert Holley waited a long time before coming to Lindau for the first time in 1984. But then he seemed to have caught on and came back every time he was invited until he passed away. Of Holley’s two co-Nobel Laureates from 1968, Har Gobind Khorana was present in 1984, while Marshall Nirenberg only accepted the invitation to participate in the 2000’s. Holley seems to be fully aware of the young scientists and students present and gives a very pedagogical presentation, speaking slowly and clearly. That the biochemist discoverer of transfer-RNA, which translates the genetic code into the protein alphabet, should speak on cell growth may not have been a surprise. But that the main topic should be how the growth factors that bind to the receptors on the cell surface can send messengers into the cell so that it starts growing, may not have been so evident. The main message of the lecture was that, at the time, the outlines of how mammalian cells grow, was pretty clear, but many details would need further research. For the students and young scientists in the audience, such a message must have been among the most cherished ones, since many of them certainly were thinking of a career in biochemistry and some even on going into research, maybe in the footsteps of Robert Holley. Hypothetically, and judging by age only, one of the 2003 Nobel Laureates in Chemistry, Roderick MacKinnon, could very well have been in the audience and could have become inspired to solve the problem of the ion channels in the cell surface!

Anders Bárány

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Robert Holley