X-ray crystallography

X-ray crystallography is a method for elucidating the structure of molecules. It enables scientists to decipher the structure of important and complex biochemical molecules and helps them to understand their function. During the 20th century, X-ray crystallography revolutionized biology. Many Nobel prizes, in physics, chemistry and physiology or medicine have been awarded for work based on X-ray crystallography. X-rays, which were discovered by Conrad Röntgen in 1895, have a wavelength that corresponds approximately to the distance between the atoms within a crystal. Therefore crystal lattices reflect X-rays and bend them into specific directions. The diffracted beams produce patterns that can be made visible and stored by means of photographic plates or other detectors. It was Max von Laue who first described this phenomenon in 1912. His discovery marks the beginning of modern crystallography and earned him the Nobel Prize in Physics in 1914. From all forms of diffraction of light, the most remarkable and most useful for measuring wavelength is the diffraction by lattices. A crystallographic theory says that nature created lattices at an atomic scale – the crystals. These are indeed lattices, having not two but three lattice constants, so called cubic lattices. One could calculate those three lattice constants, the length of this constant, to a certain level. From the density of the crystal and the mass of the atoms contained therein. But one wasn't very sure about this approach. The result was in the order of 10 to the minus 8 centimetres. And so all hope was gone to see any interactions of light at the lattice since the wavelength of light is smaller by an order of 1000. For X-rays the estimated wavelength was, according to Sommerfeld and Wien, approximately 10 to the minus 8 to 10 to the minus 10 centimetres. So one could hope for lattice interactions. By "crystal", we understand a solid, in which atoms are arranged in a regular three-dimensional crystal lattice. Snowflakes, for example, are crystals. In 1611, Johannes Kepler discovered their hexagonal shape and suspected the cause was the cold. This assumption reveals the etymological origin of the term "crystal". The ancient Greeks thought that rock crystals were forever frozen water and named it after ice: krystallos. Building on Max von Laue's discovery, William Bragg and his son Lawrence Bragg, employed the procedure of X-ray diffraction to solve the structure of simple anorganic crystals such as those of sodium chloride and diamond. For that work they were awarded the Nobel prize for physics in 1915. The structure of the crystal causes the X-ray beam to be reflected only in specific directions. The intensities of these reflections are measured. With their help, a three-dimensional image of the electron density in the crystal can be calculated, and thus, the positions of the atoms can be determined. Lawrence Bragg also established what became widely known as Bragg's law. It explains why crystals radiate X-rays only at certain angles. The regular crystal grid only allows constructive interference for certain angles and, consequently, a signal gain of the diffracted X-ray. The Bragg equation sets this angle in relation to the distance of certain grid planes of the crystal. I have always been interested in trying to apply X-ray analysis to more and more complicated bodies. And this story is the analysis of the most complicated bodies which have yet been successfully investigated – the protein structures. When we started this investigation, the hemoglobin which we chose, is a molecule containing ten thousands atoms. So far, the most complex structures, which had been investigated, where those done by Dorothy Hodgkin. In particularily the structure of Vitamin B12, which contains 181 atoms. The difficulty of getting out a structure goes up as a high power of the number of atoms in it. So we were trying to do a molecule with ten thousands atoms when the best so far had a 180. It was J.D. Bernal, a young scientist from William Bragg’s laboratory who in the 1920s conceived the idea that large biomolecules like proteins could also be crystallized and analysed using X-ray diffraction. At the Cavendish Institute in Cambridge which was later directed by Lawrence Bragg, J.D. Bernal started a project led by Max Perutz as well as one led by Dorothy Crowfoot Hodgkin. Perutz and Hodgkin both performed heroic searches of more than 20 years in quest of the structure of the proteins hemoglobin and insulin, respectively. It was Perutz’ post-doc John Kendrew, however, who succeeded in elucidating the first three-dimensional structure of a protein. Myoglobin is a protein that is responsible for transporting oxygen in the muscles. Shortly thereafter, Max Perutz deciphered the structure of hemoglobin, which is responsible for transporting oxygen in the blood. They were awarded the Nobel Prize in Chemistry in 1962. In the same year, Francis Crick, James Watson and John Wilkins won the Nobel Prize in Physiology or Medicine for elucidating the double helix structure of DNA. Dorothy Crowfoot Hodgkin was awarded an unshared Nobel Prize in Chemistry in 1964. On the way these pioneers had to overcome a large number of fundamental problems, most importantly the so-called phase problem. It is connected with the fact that the spots on a photographic plate can give you a measure of the intensity of an electromagnetic wave, but not of its phase. Since the latter is needed for a mathematically stringent extraction of the crystal structure from the diffraction data, a number of practical methods have been used to overcome this problem. One is producing crystals with and without insertions of heavy atoms and comparing diffraction data for the two kinds of crystals. But in the 1950s, the mathematician Herbert Hauptman and the physical chemist Jerome Karle showed that by solving a certain large set of equations, the crystal structure can in fact be determined in a direct method. For their theoretical solution of the phase problem they received the Nobel Prize in Chemistry in 1985. The following images of Nobel Laureates Jerome Karle and Herbert Hauptman illustrate the importance of the phases. Combining the phases of the image of Hauptman with the amplitude of the image of Karle, we get the image, as shown below left. The image below right shows what happens when you combine the phases of Karle with the amplitudes of Hauptmann. What becomes clear is how the phases dominate the resulting image. Since the 1960s, more and more complex biological molecules have been crystallized and their structures elucidated. So then, I wanted to turn back to the problem that had been interested me all along, and that was inspired by two individuals with whom I interacted a lot: Jim Watson and Francis Crick. Now, Jim was at Harvard when I was a graduate student, actually I played tennis with him, went to his group meetings, and he was working on the ribosome, so he got me interested in that area. And when I went to Cambridge, Francis of course was always around talking about everything, including the ribosome and other things. So, that got me interested in thinking about this central dogma of molecular biology, which is DNA is copied into DNA, then DNA is transcribed into RNA, and then finally RNA is transcribed into protein. So we started out on working on regulatory proteins and PLIM... and did this for many years. And we are still doing this. We are still trying to put together this entire machinery that is involved in replication, transcription, transcription regulation and this synthesis by the ribosome and I’m gonna focus on how peptide bond formation occurs. Knowledge of the crystal structure enables a deeper understanding of the three-dimensional structure at atomic level. Molecular biology establishes X-ray analysis as the fundamental method to break down and understand molecules, from the simplest compounds to the most difficult protein-nucleic acid complexes. So far, about 90,000 structures of crystalline macromolecules have been decoded. In some modern particle accelerators, called synchrotrons, brilliant X-rays are generated, which help crystallographers decode structures of macromolecules with smaller and smaller crystals. Scientific advances in X-ray analysis allow us to understand more deeply the molecules of life.

Die Röntgenkristallographie ist eine Methode zur Aufklärung von Molekülstrukturen. Mit diesem Verfahren lässt sich der Aufbau wichtiger und komplexer biochemischer Moleküle bestimmen und ihre Funktionsweise nachvollziehen. Im Laufe des 20. Jahrhunderts hat die Röntgenkristallographie die Biologie revolutioniert. Viele Nobelpreise für Physik, Chemie sowie Physiologie oder Medizin wurden für Arbeiten vergeben, die auf der Röntgenkristallographie beruhen. Die Röntgenstrahlen, die von Conrad Röntgen 1895 entdeckt wurden, weisen eine Wellenlänge auf, deren Größenordnung ungefähr dem Abstand der Atome in Kristallen entspricht. Deshalb werden Röntgenstrahlen von Kristallgittern reflektiert und in bestimmte Richtungen gebeugt. Die gebeugten Strahlen erzeugen Muster, die sichtbar gemacht und mit Hilfe von Fotoplatten oder anderen Anzeigevorrichtungen gespeichert werden können. Max von Laue hat dieses Phänomen 1912 erstmals beschrieben. Seine Entdeckung markiert den Beginn der modernen Kristallographie und brachte ihm 1914 den Nobelpreis für Physik ein. Unter allen Beugungserscheinungen am Licht ist die die kennzeichnendste und für die Wellenlängenmessung geeignetste die Beugung am Gitter. Eine alte kristallographische Theorie besagte, dass die Natur atomare Gitter geschaffen habe, nämlich in den Kristallen. Es handelt es sich dabei freilich um Gitter, nicht mit zwei, sondern mit drei Perioden, sogenannte Raumgitter. Man konnte die drei Gitter-Konstanten, d.h. die Länge dieser Perioden auch größenordnungsmäßig ausrechenen, also die Dichte der Kristalle, und aus dem Gewicht der in ihnen vertretenen Atome. Aber genau wusste man das nicht. Und man fand dafür die Größenordnung zehn hoch minus acht Zentimeter und damit war jede Hoffnung, Gitterwirkung am Licht mit solcher Raumgitter zu erhalten, von vornherein abgeschnitten. Denn die sichtbaren Wellenlängen sind ja rund tausend Mal größer. Bei Röntgenstrahlen aber lauteten die Wellenlängenschätzungen von Wien und Sommerfeld, wie wir schon sahen, auf rund zehn hoch minus acht bis zehn hoch minus neun Zentimeter. Da konnte man von vornherein auf Gitterwirkungen hoffen. Unter einem “Kristall” verstehen wir einen Festkörper, dessen Atome regelmäßig in einer dreidimensionalen Kristallgitterstruktur angeordnet sind. Ein bekanntes Beispiel dafür sind Schneeflocken. In dieser Annahme ist der etymologische Ursprung des Begriffs “Kristall” begründet. Die alten Griechen betrachteten Steinkristalle als ewig gefrorenes Wasser und benannten sie nach dem Eis: krystallos. Auf der Grundlage der Entdeckung von Max von Laue nutzten William Bragg und sein Sohn Lawrence Bragg das Verfahren der Röntgenbeugung, um die Struktur einfacher anorganischer Kristalle, wie die von Kochsalz und Diamanten, aufzuklären. Für diese Arbeit erhielten sie 1915 den Nobelpreis für Physik. Die Struktur des Kristalls beugt den Röntgenstrahl nur in bestimmten Beugungswinkeln. Die Intensität dieser Beugungen wird gemessen und aus diesen Werten eine dreidimensionale Darstellung der Elektronendichte im Kristall errechnet, aus der sich die Positionen der Atome ermitteln lassen. Lawrence Bragg stellte auch das als Braggsches Gesetz bekannt gewordene Gesetz auf, das erklärt, warum Röntgenstrahlen an einem Kristall nur in bestimmten Winkeln gebeugt werden. Das regelmäßig angeordnete Gitter lässt eine konstruktive Interferenz und demzufolge eine Detektierbarkeit des gebeugten Röntgenstrahls nur für bestimmte Einfallswinkel zu. Die Braggsche Gleichung setzt diesen Winkel in Beziehung zum Abstand bestimmter Gitterflächen des Kristalls. Ich war stets daran interessiert, die Röntgenanalyse auf immer kompliziertere Strukturen anzuwenden. Und hier geht es um die Analyse der komplexesten Strukturen, die bisher erfolgreich analysiert wurden – um die Proteine. Als wir mit den Untersuchungen begannen, war unser Untersuchungsobjekt das Hämoglobin, ein Molekül mit zehntausend von Atomen. Bis dahin waren die komplexesten Strukturen jene, die Dorothy Hodgkin untersucht hatte. Herauszuheben ist dabei die Struktur des Vitamin B12 mit 181 Atomen. Die Schwierigkeit bei der Untersuchung einer Struktur potenziert sich mit der Anzahl der Atome. Wir versuchten uns also an einem Molekül mit zehntausend Atomen, während die tiefgehendste Erforschung bis dahin nur 180 Atome betraf. Es war J.D. Bernal, ein junger Wissenschaftler aus dem Labor von William Bragg, der in den 1920-er Jahren die Idee entwickelte, große Biomoleküle, wie Proteine, zu kristallisieren und mit Hilfe der Röntgenbeugung zu untersuchen. Am Cavendish Institute in Cambridge, dessen Leitung Lawrence Bragg später übernahm, initiierte J.D. Bernal ein Projekt das zum einen Teil von Max Perutz und zum anderen von Dorothy Hodgkin geleitet wurde. Sowohl Perutz als auch Hodgkin forschten über 20 Jahre lang unermüdlich mit dem Ziel, die Struktur der Proteine Hämoglobin und Insulin zu beschreiben. Es war jedoch der in der Gruppe von Perutz tätige Postdoktorand John Kendrew, dem die Aufklärung der ersten dreidimensionalen Struktur eines Proteins schließlich gelang. Myoglobin ist ein Protein, das für den Sauerstofftransport in den Muskeln verantwortlich ist. Kurz darauf gelang Max Perutz die Entschlüsselung der Struktur von Hämoglobin, das für den Sauerstofftransport im Blut verantwortlich ist. Die beiden wurden 1962 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet. Im selben Jahr erhielten Francis Crick, James Watson und John Wilkins den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin für die Aufklärung der Doppelhelixstruktur der DNA. Dorothy Crowfoot Hodgkin wurde 1964 mit einem ungeteilten Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet. Auf ihrem Weg hatten diese Pioniere eine Menge grundlegender Probleme gelöst. Eines der bedeutendsten Probleme ist das so genannte Phasenproblem. Es hat mit der Tatsache zu tun, dass man mit Hilfe der Flecken auf einer Fotoplatte zwar die Intensität einer elektromagnetischen Welle, aber nicht ihre Phase messen kann. Da letztere aber für eine mathematisch eindeutige Folgerung der Kristallstruktur aus den Beugungsdaten benötigt wird, wurden zahlreiche praktische Methoden zur Überwindung dieses Problems eingesetzt. Eine davon ist die Erzeugung von Kristallen mit und ohne die Einbringung von schweren Atomen und ein Vergleich der Diffraktionsdaten für beide Kristallarten. In den 1950er Jahren gelang allerdings dem Mathematiker Herbert Hauptman und dem Physikochemiker Jerome Karle der Nachweis, dass sich die Kristallstruktur durch Lösung eines bestimmten umfassenden Gleichungssystems auf direktem Wege ermitteln lässt. Für ihre theoretische Lösung des Phasenproblems wurde ihnen 1985 der Nobelpreis für Chemie zuerkannt. Die folgenden Abbildungen der Nobelpreisträger Jerome Karle und Herbert Hauptman verdeutlichen die Bedeutung der Phasen. Kombiniert man die Phasen aus dem Bild von Hauptman mit der Amplitude aus dem Bild von Karle, entsteht daraus das unten links zu sehende Bild. Und das Bild unten rechts zeigt, was geschieht, wenn die Phasen von Karle mit den Amplituden von Hauptmann kombiniert werden. Es wird deutlich, wie die Phasen das resultierende Bild dominieren. Seit den 1960-er Jahren konnten zunehmend komplexe biologische Moleküle kristallisiert und ihre Strukturen aufgeklärt werden. Ich wollte mich also wieder dem Problem widmen, das mich am meisten interessierte und zu dem ich inspiriert vom häufigen Austausch mit Jim Watson und Francis Crick gestoßen war. Jim war in Harvard als ich promovierte. Wir spielten Tennis, ich ging zu seinen Gruppen-Meetings. Er arbeitete am Ribosom und das führte mich letztlich zu diesem Forschungsbereich. Und als ich nach Cambridge ging, war Francis natürlich immer irgendwo um uns. Er sprach über alles, auch über darunter auch das Ribosom. Dadurch wurde mein Interesse geweckt an diesem zentralen Dogma der Molekularbiologie: das Kopieren von DNA, die Translation zu RNA, und dann die Transkription von RNA zu Protein. Wir begannen mit der Arbeit an Regulatorproteinen und an Polymerasen … und verfolgten die Arbeit für viele Jahre. Und wir sind immer noch dabei. Wir versuchen immer noch die gesamte Maschinerie zusammenzusetzen, die beteiligt ist an der Replikation, der Transkription, der Transkriptionsregulation sowie der Synthese durch das Ribosome. Ich werde mich darauf konzentrieren, wie die Peptidbindung zustandekommt. Das Wissen über die kristalline Struktur trägt zu einem tieferes Verständnis der dreidimensionalen Struktur auf atomarer Ebene bei. Die Molekularbiologie hat die Röntgenanalyse als grundlegende Methode zur Aufschlüsselung und zum Verständnis der Moleküle – beginnend bei den einfachsten Verbindungen bis hin zu schwierigsten Proteinnukleinsäurekomplexen – etabliert. Bis heute konnten mit dieser Methode rund 90.000 Strukturen kristalliner Makromoleküle decodiert werden. In einigen modernen Teilchenbeschleunigern, so genannten Synchrotronen, werden brillante Röntgenstrahlen erzeugt, die die Kristallographen bei der Dekodierung der Strukturen von Makromolekülen immer kleinerer Kristalle unterstützen. Wissenschaftliche Fortschritte in der Röntgenanalyse ermöglichen es uns, unser Wissen über die Moleküle des Lebens weiter zu vertiefen.

Abstract

This Mini Lecture explains the method of X-ray crystallography for elucidating the structure of molecules. It enables scientists to decipher the structure of important and complex biochemical molecules and helps them to understand their function. Starting from the x-ray diffraction by crystal lattices, first described by the physicist Max von Laue, to the decoding of the most complex molecular structures, this Mini Lecture illuminates the history of the X-ray analysis.

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