For cancer diagnosis and therapy, we are developing activatable cell-penetrating peptides (ACPPs), synthetic molecules with a novel amplifying mechanism for homing to diseased tissues

Well, it’s a great pleasure to be at Lindau, which I visit every year that I can. But I have a very risky job that I’ve set myself this time because I want to talk about... give 2 short talks, about 15 minutes. And they’re 2 topics which seem to have nothing to do with each other. One of them is applied cancer research and the other is pure neurobiology. So in fact one of them is the most applied research possible. And in fact we have formed a new company even, Avelas Biosciences to commercialise the probes. And I should say right away that the first half of the talk has some commercial involvement. But the other half is very pure research and may seem to have nothing to do with the first half though you will see that they have a good deal in common of a subtle nature. The acting molecules against cancer are activatable cell penetrating peptides. ACPPs as we call them which we invented that sort of molecule. And the primary use has been for florescent imaging, matrix metalloproteinase activities, MMPs, but of course can be reasonably applied to even chemotherapy, delivering chemotherapy. And complementary technology not involving activatable cell penetrating peptides is the staining of peripheral nerve which via very humble phage display type procedure. But it proves to be quite useful in a complementary way. And as I said there’s a conflict of interest disclosure. However, the second half is molecules for long term memory storage. And that has to do with neurobiology of the peripheral net. And in general the people down the left hand column are in my lab and our outside collaborators are down the right. Varda Lev-Ram and Sakina Palida here and with mass spec help from outside, John Yates’s lab. So I have to first describe just very, very briefly the 2008 Nobel Prize in order to dismiss it, ok? If you had to pick a single photograph to encompass what I did. I created a palette, or my lab I should say created a palette, of nonoligomerizing fluorescent proteins. So we greatly improved, the green fluorescent protein and red choral florescent protein. But the essence is... And by the way this is GFP, the natural colour of the jellyfish protein. And we also gave some cute names. Such as mHoneydew, banana, orange, tomato etc. I am glad to see from yesterday that mCherry came out useful to Steve Chu. But each fluorescent protein has the common property that it was encoded by a DNA clone. And it’s not toxic, synthesisable by any aerobic organism in only 100% yield etc. and links molecular biology and biological processes with imaging. And that is its essential nature. So the fluorescent proteins have given us some major advantages. And of course we welcome the fact that fluorescent proteins have had a major impact on basic biomedical science because every one of these proteins was clonable. Most proteins and key biochemical steps can be linked in direct imaging in live cells or intact model organisms such as yeast, worms, flies, mice. The unfortunate problem comes when one wants to work on people. The first problem: Humans are too thick and opaque for whole body fluorescent scanning and therefore you have to use magnetic resonance imaging such as we just heard about from Kurt Wüthrich or x-ray CT scans or positron emission tomography or so on. But the really ugly aspect is that fluorescent proteins have to be introduced by transfection or genetic engineering of some general variety. And if you don’t use genetic engineering to introduce them, you’re not using the major power of fluorescent proteins. And unfortunately on humans gene therapy is not yet sufficiently advanced to do it. And it’s coming along but not far enough. And it will be a long time before we make transgenic human beings including the ethical problems that introduction of a fluorescent protein to make you or some part of you glow green would not directly benefit you as a patient. So for clinical applications we still felt the need for a synthetic molecules, synthetic small molecules to light up and treat diseased tissues. And therefore we turned away from the thing that got me the Nobel Prize and toward this, the first half of the talk. Most cancer deaths occur due to metastases growing in distant organs. And they of course all start at the primary tumour stage but really do you die from them. In order for cells to wander away, to metastasize, they... Here’s primary massive tumour cells and a lot of people study the tumour biology and so on. And it’s very, very important. But finally to break through the basement membrane of the blood vessels or the lymphatics, also to just carve their way through the healthy extracellular matrix, the cells have to express and over active proteases, certain proteases. And 2 of which... The best known of which are MMP2, that’s matrix metalloproteinase 2, and the same number 9 of about 25 or so total proteases. And this is so well known that these cancer cells have to activate these proteases before they can chew their way like with molecular machetes, before they chew their way through and metastasize, is that... You can even get the cartoon right off the internet. Of course this was generated by EMD Microsciences. And they sell reagents for in vitro study of proteases. But our goal was to study in vivo and to detect the activation of MMP2 and MMP9 in vivo. And to cut a long story short. The way we did so is this mechanism where a polycation up here is fused first to a payload because we want to be able to carry other things with it and a polycation has a bunch of positive charges. And in particular we just use 9 positive charges. We settled on 9. And they’re just a bunch of arginines in a row. Very, very simple. Arginine is a pos charge amino acid. And it’s a diamino acid. So it’s synthentic now, not natural amino acid. But that alone is not sufficient. We have to give this some selectivity. And the way we do that is to attach the string to 9 negative charges, matching negative charges here in the polyanion form, also deglutinated by the way. And they neutralise each other and they’re held together by virtue of a cleavable linker. So this composite 4 part chimera is made synthetically. And it does not enter cells and is pretty inactive. It goes around the blood stream and checks out tissue. But if it doesn’t find a protease the body just excretes it. It comes out staining the kidney, through the kidneys and your urine may turn a colour. But that’s all. However, if the protease is present, it cuts this cleavable linker in situ. And there snip, snip, snip and the same protease that is used in the tissue then cleaves this linker and the negative charges are thrown away. And the positive charge is now unopposed, stick to the outside of the plasma membrane first and absorb very strongly. And then some gets endocytosed and of that some gets into the cytoplasmic nucleus. So that’s the principle. Where there is protease you get a local accumulation and retention of the fluorescent dye in this construct. So let me cut this short, this discussion, and just let you detect, see what it looks like. Here is a tumour in the ear of a mouse. Can you see the tumour? I bet you don’t. And this is the problem that surgeons had for thousands of years. Tumours are not visible to the naked eye. But I’m going to start the movie and I’m going to put it into fluorescence mode. And here I illuminate with a fluorescence light. And you can see perfectly well which regions are fluorescent and therefore have the ACPPs being hydrolysed and the red dye retained. So, that’s good. Except that you can’t see your instruments. You can’t see the anatomy. So you don’t... This is not advantageous either. So what we prefer is this: an overlay mode which is false colouring the fluorescence blue green. And the reason we false colour blue-green is merely that there’s nothing natural which is blue-green in the mouse. So here we can easily distinguish between the fluorescence due to the fluorescent dye and the anatomy of the mouse. So that’s the primary tumour. And we could have cut it out. But we’re actually after the metastases. And here you see the metastases through the skin of the mouse and in the overlay mode. This is our third mode of display. Now in this mode the fluorescence is rather diffuse and attenuated because it doesn’t go very well through flesh. And that’s the problem that I alluded to. You can’t work with fluorescence through anything deep. However in a little while, just a few moments my surgical colleague, Doctor Quyen Nguyen, will come and open up the animal. There. And there of course you see the cut open tissue and in this case now the bright fluorescence or the activity of the tissue to retain the fluorescence is shown here. And here we are going to take apart the tissue and do a little dissection. And can cut out the tissue, the diseased tissue and proceed with the operation much more easily than if we had not had the fluorescence to guide us. And with this sort of method we can do a whole variety of surgeries. This happens to be pancreatic surgery done with the ACPP versus without. And it improves tumour free survival. This is a survival curve measured in weeks since the operation. And if you operate on a number of animals, we observed this traditional surgery does not save very many animals, whereas the fluorescence it does a whole lot better. And also the tumour weight at termination of 8 weeks, when we checked, killed the animals to check how well we had done. You clearly have a lot less tumour left and very little metastatic burden. And it’s statistically significant. Furthermore we can prove that in various tumour models. And so far we’ve tested something like 26 or 28 or whatever and we have not yet found a tumour model which, of either mouse or human xenograft which does not work with this type of technique. They all seem to have this MMP9, combination of MMP9 and MMP2 activity. And part of the reason it’s relatively universal is that any individual tumour doesn’t actually make all the MMPs itself. It gets the help of the tumour micro environment which is the host’s contribution. So the host pretty universally likes to make this when inflamed. And therefore we think it’s fairly general. In fact now very recently we have been able, published in 2014, we’ve been able to hitch this same system, instead of delivering a fluorescent dye, we just deliver a conventional cancer chemotherapeutic. In this case it’s so called monomethylauristatin which is a potent microtubule inhibitor. But it then now can regress orthotopic xenografts in early trials. And this monomethylauristatin is actually used attached via the same technology as used currently in antibody directed conjugates. But this does not use an antibody. It’s using an ACPP in our technology to deliver the same type of story. So percent survival, we get cures. Not every animal was cured but a significant number are cured with the ACPP, whereas the equal same concentration of drug applied, free or with various controls, is not sufficient to save a single one. Now how about the nerves? Counter labelling nerve is a challenging problem. In surgery you do not want to cut the nerves. You want to cut the cancer but spare the nerves. And current methods for finding nerves have great problems. So, peripheral nerves turn out to have distinctive surface molecules. You don’t have to do this ACPP complicated mechanism. You just use phage display. You get sequences such as NTQTLAKAPEHT. And eventually fluorescently label them. And it lights up the nerves. So let me give you an example here. So this is the flank, the hind flank here of the mouse. And you can’t see the tumour or the nerve yet. I haven’t opened it up. But you agree you can’t see where the tumour boundaries are. But we’re going to, that’s the tumour itself. And here is the boundaries of the tumour in the overlaying mode. Except that today we chose to use green, a GFP colour but it’s arbitrary. The computer just puts green colour. So here now we have naked, exposed a little more nakedly. We’re doing the cancer surgery and Doctor Nguyen actually doesn’t cut this fast, its speed up about 2-fold. But you are revealing the nerves. And you can see that all this region here was a hunk of pseudo coloured green tissue which you want to get rid of. And here is the sciatic nerve revealed, which you will want to preserve. But you have... And you can see it, there happens to be a fork here, you will have to separately cut out, preserve the branch. Save out the branch and the main trunk right? Well you just made a mistake. You’re about to make a mistake. You will paralyse the animal. Because, in a moment, that’s the fluorescence of the nerve highlighting peptide. The actual nerve just does a zigzag and rapidly dives into the tumour tissue here. And you would have missed it by just reflected light illumination. Now of course we prefer to combine it in pseudo colour mode. But using a different wave length to distinguish, today blue is good. And blue-green is what you want to save. And the green is what you want to cut out, ok? So makes it fairly simple. Even a more practical, clinically practical example is shown here of rat cavernosal nerve. Now what you think is the cavernosal nerve. Well at least half of, slightly half, less than half the audience ought to know because it mediates male erections. And this is the great danger of prostate cancer surgery. When accidently the prostate is damaged. Well the prostate must be removed but the nerves running through the prostate can be very readily damaged. And can you see the nerves. I suspect it’s rather difficult. This happens to be a rat. But here you can see the nerves running through. Once you turn on the fluorescence illumination. So here too even a more practical sense, you have a benefit. So, synthetic contrast mechanism for clinical application currently, we already have a mechanism of cleavage activated uptake which delivers contrast agents for optical. I haven’t shown you magnetic resonance imaging but it does for MRI and chemotherapeutic agents. And though I emphasised here metastatic ability, if you switch to different enzymes such as thrombin for thrombosis, you can also measure these other biological processes and disease processes. The nerve homing peptide represents complementary non-amplifying labelling which happens to be complementary, as you see, but of entirely different mechanism. Each has some unwanted background tissue. And honestly if I had GFP at my disposal, a lot would be easier. I’d have a lot cleaner background, a lot greater specificity. But I don’t, can’t use GFP so I have to do this not so good... I genuinely don’t have the technology with GFP. But earliest clinical application will be in image guided surgery. Drug delivery will be difficult because there is some background labelling. And produce showing that the dye goes in the wrong position. But it is important to work in vivo and directly with clinicians. Now the second half, I’m sorry I’m running late. But the hypothesis that I wish to explore and seemingly unrelated to the first half of the talk is that lifelong memories are stored as the pattern of holes in the perineuronal net, the PNN which is a rather strange specialised form of extracellular matrix deposited around selected neurons during critical periods in the brain. And the PNN is interrupted by holes where synapses occur. And this is the essence. And where there are large holes in the PNN naturally you can make a strong synapse because you’ve got a lot of surface area. Small holes make weak or even no holes make no connections. And therefore the PNN sort of serves as a punch card in... Well I don’t know, how many... Maybe you younger people don’t even remember punch cards. But the older guys do. That’s how the oldest form of computer memory storage was had. But of course it’s in 3 dimensions. The stability of synaptic strength in memory states is what actually stores the memory from moment to moment. But that, I postulate, comes from the stability of the PNN. And the great advantage of the PNN is that its molecules can last a lifetime with no turnover whereas the synaptic background molecules, because of the proteasome, ubiquitin pathways, autosomes, phagasome etc, they turn over every few days. So there’s now no need to postulate a copying mechanism that preserves the information which we would have to copy a hundred or thousands of times if we relied on the synaptic macromolecules. And unlike intracellular proteins, extra cellular matrix lacks an automatic turnover like the ubiquitin system etc. etc. Of course it can be degraded and then you have to call upon synapsis specialised proteases. So this is the structure and biochemistry, a little bit of the perineuronal net. It’s this complicated meshwork made of these specialised constituents, aggrecan, versican, neurocan etc, hyalronan and all stuck to the plasma membrane in both places except where synapses occur. And then you have a synapse. The PNNs are excluded from synapses and where there’s a synapse you don’t have the PNN as we can see here according to this recent micrograph. Actually the existence of the PNN was noted as usual in neurobiology all the way back to Ramón y Cajal. So he always got things first. Here from the literature is a higher power electron micrograph of a cortical neuron. And you can sort of see how this makes a punctuated dark deposit... well stained with a dark deposit diaminobenzidine. That’s the PNN. And where there in the gaps between the PNN are the synapses as shown here. This is a pre synaptic axon, a synapse with the post synaptic density surrounded by PNN. So my metaphor and this is a seductive metaphor is the synapse is like a gateway between the cells. Right? This cell near here and on the other side another cell. But the PNN is like the wall in which the gateway is inserted. And what maintains the exact position of the gateway? Well, you see all this tremendous lot of activity and people coming in and out of the gateway. It’s by the way the Damascus Gate in Jerusalem. The evening comes by. But what maintains is the position and size of the gate. What remembers where the gate way ought to be? The stone wall. And we ought to not forget the stone wall. Of course until modified by masons. Now, this is some evidence that intercellular proteins don’t last that long. As if we had to have evidence. A rat cortical neurons or their synaptic proteins have a half-life all uniformly of a few days. And very occasionally you get these long lived ones. And in this sample even these were the extra cellular aggregation proteins. We have begun to measure the lifetime of the PNN which had never been done before. And so far we’ve only done 180 days, 6 months. And the experiments are ongoing to do longer periods. But if you’re doing an experiment like this, you raise them until they’re young adults on nitrogen 15 and then switch them to nitrogen 14 for a long period like 6 months and then sacrifice them. What happens? You see that all the synaptic... the PNN is still heavy showing that it was laid down early, up to P45. And then it persists there. And the exact isotopic ratio until you check the aged animal. Or you can do the experiment in reverse whereas of course if you check it, the synaptic proteins the conventional synaptic proteins can’t keep hold of the isotope. They immediately flush out the isotope in a few days. It’s not quite as fast as I showed in the previous slide because of the limitations of working on whole animals and isotope washout in whole animals is a little bit slower. One will eventually have ability to look at people in the cadaver specimens using the nitrogen... the carbon 14 left over by nuclear bomb testing in the Test Ban Treaty of 1963. That was a wonderful natural experiment involving radioactive labelling done on everybody alive on earth. And it is possible to do the same experiment. But we have yet to try it. We’re going to do it soon. So proposed molecular memory mechanisms, I list here 4 mechanisms. The 3 current in the literature are from John Lisman, CaM kinase 2. Todd Sacktor proposed PKMzeta. Eric Kandel, another Nobel laureate proposed CEPB. Of course all of the proteins proposed up to now had inside the post synaptic compartment, whereas I am proposing that we ought to look just outside the synapse. They all have different synaptic activation. And I don’t have time to discuss them. But they all, in order to allow themselves to be copied and copied and copied repetitively because of the short half-life and yet the long term information storage, they have to propose these various complicated mechanisms where the essence of the idea is that, I postulate a protein that does not need re-copying because it doesn’t turn over. And by the way it explains critical periods because up to the time you lay down the proteins you don’t have anything to memorise. You cannot memorise until you label and stop turning over. So literature evidence for proteolytic degradation... Well we haven’t contributed. There is already in the literature proteases such as, well guess what MMP9, how boring, are locally translated and secreted in response to synaptic activity. Local puffing of MMP9 onto neural spines can mimic the growth of the spines, the enlargement and potentiation. Here is a bit of new stuff. Global disruption with chondritinase. Now you have the use of some different enzymes of the PNN can reopen critical periods. So that it’s well-known, or at least it was in the literature that if the ocular dominance period cannot be changed in an adult unless you put on this enzyme for a little while, chew up the old extracellular matrix and then allow the animal to re-establish synaptic, re-establish the PNN. During that period you can test their eyes again and re-establish ocular dominance columns. And finally inhibitors are supposed to block potentiation. Now, I don’t know that MMP’s are really that essential or primary they have just got the most reagents that you can buy. Other enzymes may be important but I believe that some sort of combination of enzymes will be necessary. Now we wish that we could directly implant or delete specific memories but this requires knowing how the even more difficult problem of in general how synaptic activity encodes experiences. And that’s too hard a problem for us to solve, a grander problem. So let me just observe that stable information storage, we know as writing and reading. That’s what we call storage of information in non-volatile format. And it’s essentially for stability and civilisation. That’s why we have a process of writing and reading and do not try to use purely oral transmission from generation to generation. And I should note, you may not think that making holes is a good form of storage. But remember the lowest tech permanent media are like clay tablets or carving in stone or even tearing your ticket when you go to the theatre. They instantly have to show that you are... prove that you, in an unforgeable manner, that you’ve used the ticket. They just tear it. And that’s... You don’t need a complicated mechanism, don’t have to learn how to write, you don’t need pens and pencils. You just tear. Of course it matches with the clinical observation that early memories are better preserved, often better preserved than recently formed ones because of the different system involved. So, I don’t say that this is the only mechanism, but I think it should be considered as a complement to the traditional, more traditional intrasynaptic memories. And I hope you’ve noticed that the extracellular matrix is also a neglected subject which deserves more credit or attention. And we have tended to think that this is just so boring. But there may be something there. Thank you. Applause.

Es ist eine große Freude für mich, hier in Lindau zu sein, und wenn ich kann, bin ich jedes Jahr hier. Aber diesmal habe ich mir selbst eine sehr gewagte Aufgabe vorgenommen, denn ich will reden über … ich will 2 kurze Vorträge halten, jeweils rund 15 Minuten. Und das sind 2 Themen, die auf den ersten Blick nichts miteinander zu tun zu haben scheinen. Zum einen geht es um angewandte Krebsforschung und zum anderen um reine Neurobiologie. Tatsächlich geht es also bei dem einen Vortrag um die „angewandteste“ Forschung, die möglich ist. Wir haben sogar ein neues Unternehmen gegründet, Avelas Biosciences, um die Sonden zu vermarkten. Und ich sollte direkt anmerken, dass die erste Hälfte des Vortrages in gewisser Hinsicht mit kommerziellen Interessen zu tun hat. Aber in der zweiten Hälfte geht es um reine Forschung und die scheint mit der ersten Hälfte überhaupt nichts zu tun zu haben, obwohl beide Themen auf einer subtilen Ebene vieles gemeinsam haben. Die gegen Krebs wirkenden Moleküle sind aktivierbare zellgängige Peptide (activatable cell penetrating peptides), ACPPs, wie wir sie bezeichnen, die, also diese Molekülart, wir erfunden haben. Und der hauptsächliche Einsatz erfolgt bisher im Fluoreszenz-Imaging, in Matrix-Metalloproteinase-Aktivitäten, MMPs, aber natürlich können sie auch sinnvoll in der Chemotherapie, also für Chemotherapiebehandlungen, eingesetzt werden. Eine komplementäre Technologie ohne Einsatz von aktivierbaren zellgängigen Peptiden ist die Einfärbung peripherer Nerven, was ein sehr einfaches Phagen-Display-Verfahren ist. Aber es hat sich als ziemlich nützliches Komplementärverfahren herausgestellt. Und wie ich bereits sagte, gibt es eine Erklärung zu potenziellen Interessenkonflikten. Allerdings beschäftigt sich die zweite Hälfte des Vortrags mit Molekülen für die Langzeitgedächtnisspeicherung. Und das Thema hat mit der Neurobiologie des peripheren Netzes zu tun. Grundsätzlich sind die hier unten links genannten Mitarbeiter in meinem Labor tätig und unsere externen Kollegen werden unten rechts genannt. Varda Lev-Ram und Sakina Palida hier und das Labor von John Yates mit Massenspektrometer-Unterstützung von außen. Zunächst aber muss ich einmal sehr kurz den Nobelpreis 2008 erklären, um Ihnen eine Idee davon zu geben, was ich gemacht habe. Ich, oder ich sollte besser sagen: mein Labor hat eine Palette von nicht-oligomerisierenden Fluoreszenzproteinen geschaffen. Wir haben also das grüne Fluoreszenzprotein und das rote Korallen-Fluoreszenzprotein deutlich verbessert. Doch die Quintessenz ist … übrigens das hier ist GFP, die natürliche Farbe des Quallenproteins. Und wir haben auch einige hübsche Namen vergeben. Wie beispielsweise mHonigmelone, mBanane, mOrange, mTomate usw. Ich habe mich gefreut, gestern zu erleben, dass sich mCherry für Steve Chu als nützlich erwiesen hat. Aber jedes Fluoreszenzprotein hat die gemeinsame Eigenschaft, dass es durch einen DNA-Klon kodiert wurde. Und es ist nicht toxisch, über jeden aeroben Organismus mit 100% Ausbeute synthetisierbar und verbindet die Molekularbiologie und biologische Prozesse mit Bildgebungsverfahren. Und das ist seine wesentliche Natur. Die Fluoreszenzproteine haben uns also einige bedeutende Vorteile geliefert. Und natürlich begrüßen wir die Tatsache, dass Fluoreszenzproteine bedeutende Auswirkungen auf die grundlegende Biomedizinwissenschaft hatten, weil jedes dieser Proteine geklont werden konnte. Die meisten Proteine und die wichtigsten biochemischen Schritte können direkt in lebenden Zellen oder intakten Modellorganismen wie Hefe, Würmern, Fliegen, Mäusen abgebildet werden. Das bedauerliche Problem entsteht erst, wenn man an Menschen arbeiten möchte. Das erste Problem: Menschen sind zu dick und undurchlässig für ein Ganzkörper-Fluoreszenz-Scanning und deshalb muss man mit Kernspinresonanzmethoden arbeiten, wie wir gerade von Kurt Wüthrich gehört haben, oder mit Röntgen-CT-Technik oder mit der Positronen-Emissionstomographie (PET) usw. Aber die wirklich unangenehme Seite ist die, dass Fluoreszenzproteine irgendwie über Transfektion oder Gentechnik eingebracht werden müssen. Und wenn man keine Gentechnik einsetzt, um die Fluoreszenzproteine einzubringen, lässt man die wesentliche Leistungsfähigkeit von Fluoreszenzproteinen ungenutzt. Und bedauerlicherweise ist die humane Gentherapie noch nicht weit genug fortgeschritten, um so vorzugehen. Es geht zwar weiter, aber nicht weit genug. Und es wird noch lange dauern, bevor wir transgene menschliche Wesen produzieren, ganz zu schweigen von den ethischen Problemen, die damit verbunden sind, dass der Mensch oder Teile von ihm durch Einbringung eines Fluoreszenzproteins grün leuchten würden, was einem als Patient nicht gerade direkt zugutekäme. Deshalb sahen wir für klinische Anwendungen nach wie vor einen Bedarf an synthetischen Molekülen, synthetischen kleinen Molekülen, um erkrankte Gewebe markieren und behandeln zu können. Und deshalb haben wir uns von dieser Sache abgewandt, die mir den Nobelpreis einbrachte, und dem Thema zugewandt, dem die erste Hälfte dieses Vortrags gewidmet ist. Die meisten Todesfälle durch Krebs entstehen aufgrund von Metastasen, die in entfernten Organen wachsen. Und natürlich starten sie alle im Stadium des Primärtumors, aber letztendlich stirbt man an ihnen. Damit Zellen wandern, Metastasen bilden, müssen sie … hier sind massive Primärtumorzellen und viele Menschen erforschen die Tumorbiologie usw. Es ist sehr, sehr wichtig. Aber damit die Zellen letztendlich die Basalmembran der Blutgefäße oder der Lymphgefäße durchbrechen und sich ihren Weg durch die gesunde extrazelluläre Matrix bahnen können, müssen sie Proteasen exprimieren und übermäßig aktivieren, bestimmte Proteasen. Und 2 davon … die am bekanntesten sind MMP2, das ist die Matrix-Metalloproteinase 2 und die gleiche mit der Nr. 9 von ungefähr 25 Proteasen. Und es ist auch sehr gut bekannt, dass diese Krebszellen diese Proteasen aktivieren müssen, bevor sie sich wie molekulare Macheten ihren Weg bahnen und metastasieren können ... Der Cartoon dazu ist direkt im Internet zu finden. Dieser hier wurde natürlich von EMD Microsciences erstellt. Das Unternehmen verkauft Reagenzien für In-vitro-Studien von Proteasen. Unser Ziel war es aber, in vivo zu untersuchen und die Aktivierung von MMP2 und MMP9 in vivo zu erfassen. Lange Rede kurzer Sinn: Die Art und Weise, wie wir das bewältigten, ist dieser Mechanismus, bei dem eine Polykation-Komponente zunächst auf eine Abgabe-Payload verschmolzen wird, weil wir in der Lage sein wollen, gleichzeitig andere Dinge damit zu transportieren und eine Polykation-Komponente hat eine Menge positiver Ladungen. Und konkret verwenden wir genau 9 positive Ladungen - wir haben uns einfach auf 9 festgelegt. Und das ist einfach ein Bündel von Argininen in einer Reihe. Sehr, sehr einfach. Arginin ist eine positiv geladene Aminosäure. Und es ist eine Diaminosäure. Das ist jetzt also synthetisch, keine natürliche Aminosäure. Aber das allein reicht nicht. Wir müssen hier selektiv vorgehen. Und das tun wir, indem wir die Kette an 9 negative Ladungen anhängen, die den negativen Ladungen hier in der Polyanionform entsprechen – übrigens auch deglutiniert. Sie neutralisieren sich gegenseitig und sie werden durch einen spaltbaren Linker zusammengehalten. Diese aus 4 Teilen bestehende Chimäre ist synthetisch hergestellt. Sie dringt nicht in Zellen ein und ist ziemlich inaktiv. Sie bewegt sich im Blutstrom und checkt Gewebe. Wenn sie keine Protease findet, wird sie vom Körper einfach ausgeschieden. Sie wird über die Nieren ausgeschieden und verfärbt die Niere und den Urin. Das ist alles. Wenn jedoch Protease vorhanden ist, trennt sie diesen spaltbaren Linker vor Ort ab. Und dieselbe Protease, die im Gewebe verwendet wird, spaltet dann diesen Linker ab und die negativen Ladungen werden entfernt. Und die positive Ladung hat jetzt keinen Gegenspieler mehr, heftet sich zunächst an die Außenseite der Plasmamembran und integriert sich sehr stark. Und dann werden einige endozytiert und einige davon gelangen in den Zytoplasmakern. Das ist also das Prinzip. Wenn Protease vorhanden ist, entsteht eine lokale Akkumulation und Speicherung des fluoreszierenden Farbstoffs in diesem Konstrukt. Lassen Sie mich das Ganze abkürzen und konkret werden. Versuchen Sie einmal zu erkennen, was hier zu sehen ist. Das hier ist ein Tumor im Ohr einer Maus. Können Sie den Tumor sehen? Ich wette, Sie sehen ihn nicht. Und das ist genau das Problem, das Chirurgen Tausende von Jahren hatten. Für das bloße Auge sind Tumoren unsichtbar. Aber ich lasse den Film gleich laufen und stelle ihn auf den Fluoreszenzmodus ein. Und ich beleuchte das Ganze mit einem Fluoreszenzlicht. Und dann sehen Sie exakt, welche Regionen fluoreszent sind und also die ACPPs aufweisen, die hydrolysiert werden und den roten Farbstoff speichern. Das ist also gut. Außer, dass man seine Instrumente nicht sehen kann. Man kann die Anatomie nicht erkennen. Man kann nicht … auch das ist also nicht von Vorteil. Deshalb bevorzugen wir dies: Ein Überblendungsmodus, der die Fluoreszenz in der Falschfärbung blau-grün anzeigt. Und der Grund dafür, dass wir die Farbe in blau-grün falschfärben, ist einfach der, dass es in der Maus nichts gibt, was natürlicherweise blau-grün wäre. So können wir einfach zwischen der Fluoreszenz aufgrund der Fluoreszenzfarbstoffe und der Anatomie der Maus unterscheiden. Das ist also der Primärtumor. Den hätten wir also herausschneiden können. Aber es geht in Wirklichkeit um die Metastasen. Und hier sehen Sie die Metastasen im Überblendungsmodus durch die Haut der Maus durchscheinen. Dies ist unser dritter Displaymodus. In diesem Modus ist die Fluoreszenz ziemlich diffus und abgeschwächt, weil sie nicht gut durch das Fleisch hindurch dringt. Und das ist das Problem, das ich schon erläutert habe. Mit Fluoreszenz kann man etwas Tiefes nicht durchdringen. Aber gleich wird mein chirurgischer Kollege, Doktor Quyen Nguyen, auftauchen und das Tier aufschneiden. Und da sehen Sie natürlich das aufgeschnittene Gewebe und hier sehen Sie die helle Fluoreszenz; die Aktivität des Gewebes, das die Fluoreszenz speichert, wird hier gezeigt. Und hier trennen wir das Gewebe heraus und nehmen eine Dissektion vor. Und dann können wir das Gewebe herausschneiden, das erkrankte Gewebe, und die Operation wesentlich einfacher fortsetzen, als wenn wir uns nicht an der Fluoreszenz hätten orientieren können. Und mit dieser Vorgehensweise können wir eine Vielzahl von Operationen durchführen. Und hier geht es um einen Vergleich der Pankreasoperation mit ACPP gegenüber der Operation ohne diese Technik. Die neue Technik verbessert die tumorfreien Überlebensraten. Dies hier ist eine Überlebenskurve, gemessen in Wochen nach der durchgeführten Operation. Wir haben festgestellt, dass diese traditionelle Chirurgie nicht viele Tiere retten konnte, während die Fluoreszenzchirurgie wesentlich besser abgeschnitten hat. Und auch die nach acht Wochen durchgeführte Kontrolle des Tumorgewichts, für die wir die Tiere töteten, um das Operationsergebnis feststellen zu können, ergab eine wesentlich geringere Tumormasse und eine sehr geringe Metastasenbelastung. Und das ist statistisch signifikant. Und zudem können wir diese Ergebnisse in verschiedenen Tumormodellen nachweisen. Bis heute haben wir 26 oder 28 verschiedene Modelle getestet und dabei kein Tumormodell gefunden Sie alle scheinen diese MMP9, die Kombination von MMP9- und MMP2-Aktivität aufzuweisen. Und ein Teil der Begründung für die relative Universalität ist die, dass jeder individuelle Tumor nicht alle MMPs tatsächlich selbst erzeugt. Er wird dabei von der Mikroumgebung des Tumors unterstützt – einem Beitrag des Wirtsorganismus. Der Wirtsorganismus scheint diese Vorgänge generell gerne anzustoßen, wenn er entzündet ist. Und deshalb halten wir diese Beobachtung für ziemlich grundsätzlich. Tatsächlich waren wir vor kurzem in der Lage – wir haben das 2014 veröffentlicht, In diesem Fall ging es um das so genannte Monomethylauristatin, einen potenten Mikrotubulus-Hemmer. Er konnte in ersten Versuchen orthotopische Xenotransplantate regredieren. Und dieses Monomethylauristatin wird über dieselbe Technologie eingebracht, wie sie derzeit bei Antikörpern gegen Konjugate genutzt wird. Aber hierbei wird statt eines Antikörpers ein ACPP eingesetzt, um dasselbe zu bewirken. Wir erreichen prozentuale Überlebensraten. Nicht jedes Tier konnte geheilt werden, aber mit dem ACPP konnte eine erhebliche Zahl geheilt werden, während die Anwendung der gleichen Wirkstoffkonzentration Was passiert mit den Nerven? Ein Counter-Labelling der Nerven stellt ein herausforderndes Problem dar. In der Chirurgie möchte man die Durchtrennung der Nerven vermeiden. Den Krebs will man zwar herausschneiden, aber die Nerven dabei aussparen. Die derzeitigen Methoden zur Identifizierung von Nerven bereiten große Probleme. Es hat sich herausgestellt, dass periphere Nerven spezielle Oberflächenmoleküle aufweisen. Deshalb braucht man diesen komplizierten ACPP-Mechanismus nicht durchzuführen. Man kann einfach die Phagen-Display-Technologie anwenden. Dann erhält man Sequenzen wie NTQTLAKAPEHT. Und schließlich werden sie mit Fluoreszenz markiert. Und dadurch leuchten die Nerven auf. Hier sehen Sie ein Beispiel. Das hier ist die Flanke, die angedeutete Flanke der Maus. Und man sieht hier weder den Tumor noch den Nerv. Ich habe es nicht geöffnet. Aber Sie werden mir zustimmen, dass man hier den Grenzverlauf des Tumors nicht erkennen kann. Aber wir gehen weiter und das hier ist der Tumor. Und hier sind die Grenzen des Tumors im Überblendungsmodus zu erkennen. Mit dem Unterschied, dass wir heute den Einsatz von grün gewählt haben, eine GFP-Farbe, aber das ist beliebig. Der Computer nimmt nun mal die grüne Farbe. Hier sehen wir das Ganze jetzt etwas unverhüllter. Wir führen die Krebsoperation durch und Doktor Nguyen schneidet natürlich in Wirklichkeit nicht so schnell. Das hier ist eine Zeitraffer-Darstellung, ungefähr doppelt so schnell. Aber die Nerven werden frei gelegt. Man kann hier sehen, dass diese gesamte Region ein großes Stück pseudogefärbtes grünes Gewebe war, das man entfernen möchte. Und hier wird der Ischiasnerv freigelegt, den man erhalten möchte. Aber man hat … man sieht, dass hier eine Verzweigung liegt, man muss das separat herausschneiden, die Verzweigung erhalten. Man muss die Verzweigung erhalten und den Hauptstamm hier. Aber hier macht man schnell einen Fehler. Dann wäre das Tier gelähmt. Denn das ist die Fluoreszenz des Peptids, das den Nerv kennzeichnet. Der Nerv selbst schlägt einen Zickzackkurs ein und dringt hier tief in den Tumor ein. Und das hätte man aufgrund der einfachen Lichtreflektion nicht erkannt. Deshalb kombinieren wir das mit dem Pseudofarbmodus. Zur Unterscheidung verwenden wir eine unterschiedliche Wellenlänge, dazu ist Blau gut. Und das Blaugrüne ist das, was wir erhalten möchten. Und das Grüne ist das, das wir heraustrennen wollen, okay? Das macht es ziemlich einfach. Hier ist ein praktischeres Beispiel, ein Beispiel aus der klinischen Praxis zu sehen, nämlich der Schwellkörpernerv der Ratte. Was Sie hier sehen, ist der Schwellkörpernerv. Wenigstens ungefähr die Hälfte des Publikums hier dürfte ihn kennen, weil er für die männliche Erektion zuständig ist. Aber genau das ist die große Gefahr bei Prostatakrebsoperationen, wenn die Prostata aus Versehen beschädigt wird. Die Prostata muss entfernt werden, aber dabei können auch die durch die Prostata verlaufenden Nerven sehr schnell beschädigt werden. Sehen Sie die Nerven hier? Ich vermutete, dass das sehr schwierig ist. Das hier ist eine Ratte. Sie sehen die dort verlaufenden Nerven. Wenn die Fluoreszenzbeleuchtung aktiviert ist, sieht man hier den ganz praktischen Vorteil. Mit dem synthetischen Kontrastmechanismus für klinische Anwendungen haben wir heute bereits einen Mechanismus der spaltungsaktivierten Aufnahme, der Kontrastmittel für die optische Darstellung liefert. Ich habe Ihnen keine Magnetresonanztomographie gezeigt, aber es funktioniert für MRT und chemotherapeutische Medikamente. Und auch wenn ich hier die metastatische Fähigkeit betont habe, lassen sich so auch durch Umschaltung auf andere Enzyme, wie beispielsweise Thrombin für die Thrombose, andere biologische Prozesse und Krankheitsprozesse verfolgen. Das auf Nerven abzielende Peptid repräsentiert ein komplementäres, nicht-verstärkendes Labelling, das zwar komplementär ist, wie Sie sehen, aber einem völlig anderen Mechanismus folgt. Hier liegt jeweils ein unerwünschter Gewebehintergrund vor. Und wenn ich ehrlich bin, wäre alles wesentlich einfacher, wenn mir GFP zur Verfügung stünde. Ich hätte einen wesentlichen klareren Hintergrund, eine höhere Spezifität. Aber das ist nicht der Fall, ich kann GFP hier nicht einsetzen … mir steht die Technologie mit GFP einfach nicht zur Verfügung. Aber die früheste klinische Anwendung wird die bildgesteuerte Chirurgie sein. Der pharmazeutische Wirkstofftransport wird schwierig sein, weil ein Background-Labelling entsteht. Und hier ist zu sehen, dass der Farbstoff in die falsche Position geht. Aber es ist wichtig, in vivo und direkt mit Klinikern zusammenzuarbeiten. Nun zur zweiten Hälfte meines Vortrags. Es tut mir leid, dass ich in Verzug bin. Aber die Hypothese, mit der ich mich beschäftigen möchte und die anscheinend mit der ersten Hälfte des Vortrages überhaupt nichts zu tun hat, ist die Tatsache, dass lebenslange Erinnerungen quasi als Lochmuster im perineuronalen Netz, dem PNN, gespeichert werden, eine ziemlich seltsame, spezialisierten Form der extrazellularen Matrix, die während kritischer Perioden im Gehirn rund um ausgewählte Neuronen abgelagert wird. Und das PNN wird dort durch Löcher unterbrochen, an denen Synapsen auftreten. Und das ist das Entscheidende. Wo große Öffnungen im PNN bestehen, können natürlicherweise starke Synapsen hergestellt werden, weil eine große Oberfläche zur Verfügung steht. Schmale Öffnungen sorgen dafür, dass nur schwache Verbindungen entstehen. Fehlende Löcher machen Verbindungen unmöglich. Und deshalb dient das PNN quasi als Lochkarte in … nun ich weiß nicht, wie viele - vielleicht können Sie sich als jüngere Menschen gar nicht an Lochkarten erinnern. Aber die älteren Leute hier können das bestimmt. Das gehörte zu der ältesten Form des Computerspeichers. Aber natürlich ist das dreidimensional. Die Stabilität der synaptischen Übertragungsstärke ist für den Gedächtniszustand das, was das Gedächtnis tatsächlich von Moment zu Moment abspeichert. Aber das, so meine These, kommt von der Stabilität des PNN. Und der großartige Vorteil des PNN ist der, dass seine Moleküle ohne Fluktuation ein Leben lang bestehen können, während sich die synaptischen Hintergrundmoleküle aufgrund von Proteasom, Ubiquitin-Signalwegen, Autosomen, Phagasomen usw. alle paar Tage umsetzen. Es gibt also heute keinen Grund, einen Kopiermechanismus vorauszusetzen, der die Informationen erhält, die wir hunderte oder tausende Male kopieren müssten, wenn wir uns auf die synaptischen Makromoleküle stützen würden. Und im Gegensatz zu intrazellulären Proteinen mangelt es der extrazellulären Matrix an einem automatischen Umsatz wie dem Ubiquitin-System usw. Natürlich kann sie abgebaut werden und dann muss man auf synapsen-spezifische Proteasen zurückgreifen. Das hier sind also die Struktur und die Biochemie, ein Teil des perineuronalen Netzes. Es ist ein komplexes Netzwerk, das aus diesen speziellen Bestandteilen besteht, Aggrecan, Versican, Neurocan usw. Hyalronan und alle hängen an beiden Stellen an der Plasmamembran, außer dort, wo Synapsen vorkommen. Und dann hat man eine Synapse. Die PNN sind von Synapsen ausgeschlossen. Wo eine Synapse besteht, gibt es kein PNN, wie wir anhand dieser kürzlich entstandenen Aufnahme erkennen können. Tatsächlich wird die Existenz des PNN in der Neurobiologie bis hin zurück zu Ramón y Cajal als normal angenommen. Er hat die Dinge immer zuerst herausgefunden. Hier sehen Sie eine stärkere elektronenmikroskopische Aufnahme eines kortikalen Neurons. Und man kann sehen, wie hier eine gepunktete, dunkle Ablage entsteht, gut eingefärbt mit einer starken Ablagerung von Diaminobenzidin. Das ist das PNN. Und dort in den Lücken zwischen dem PNN sind die Synapsen, wie hier zu sehen ist. Das ist ein präsynaptisches Axon, eine Synapse mit postsynaptischer Dichte, umgeben von PNN. Meine Metapher ist also – und das ist eine verführerische Metapher –, dass die Synapse wie ein Tor zwischen den Zellen fungiert. Okay? Diese Zelle hier und auf der anderen Seite eine andere Zelle. Aber das PNN ist wie die Mauer, in die das Tor eingefügt ist. Und was hält die exakte Position des Tors aufrecht? Nun, Sie sehen hier diese enormen Aktivitäten und all die Menschen, die das Tor passieren. Es ist übrigens das Damaskustor in Jerusalem. Der Abend naht. Aber was bleibt, sind Position und Größe des Tors. Was erinnert daran, wo sich das Tor befinden sollte? Die Steinmauer. Wir sollten die Steinmauer nicht vergessen, solange sie nicht von Maurern verändert wird. Nun gibt es wohl einige Anzeichen dafür, dass interzelluläre Proteine nicht so lange bestehen. Als ob wir diese Nachweise gebraucht hätten! Die kortikalen Neuronen einer Ratte oder deren synaptische Proteine haben alle eine einheitliche Halbwertzeit von einigen wenigen Tagen. Und nur sehr gelegentlich gibt es diese langlebigen Exemplare. Und in diesem Beispiel waren dies die extrazellulären Aggregationsproteine. Wir haben begonnen, die Lebensdauer des PNN zu messen, was nie vorher gemacht worden war. Und bisher haben wir nur 180 Tage, 6 Monate erreicht. Die Experimente laufen für längere Zeiträume weiter. Aber wenn man ein solches Experiment wie dieses durchführt, zieht man sie auf Nitrogen 15 heran, bis sie junge Erwachsene sind. Und dann stellt man sie für eine längere Zeit, etwa 6 Monate, auf Nitrogen 14 um und dann tötet man sie. Und was passiert? Sie sehen, dass die gesamten synaptischen … das PNN ist noch stark und zeigt, dass es bereits früh statuiert wurde, bis zu P45. Und dann bleibt es dort bestehen, das exakte Isotopenverhältnis, bis man das gealterte Tier überprüft. Oder man kann das Experiment umgekehrt durchführen, wobei natürlich die synaptischen Proteine, die konventionellen synaptischen Proteine das Isotop nicht halten können, wenn man das kontrolliert. Sie spülen das Isotop innerhalb weniger Tage heraus. Das geht nicht ganz so schnell, wie ich das in der vorherigen Folie gezeigt habe, und zwar aufgrund der Einschränkungen bezüglich der Arbeit mit ganzen Tieren. Der Isotopenzerfall bei ganzen Tieren verläuft etwas langsamer. Man wird schließlich die Möglichkeit haben, Leichenproben von Menschen mit Hilfe von Nitrogen zu untersuchen … die Kohlenstoff-14-Rückstände nach den Atombombentests im Rahmen des Atomteststoppabkommen 1963. Das war ein wunderbares Naturexperiment mit radioaktivem Labelling aller Lebewesen auf Erden. Es ist möglich, das Experiment zu wiederholen. Aber das müssen wir noch ausprobieren. Wir wollen es bald in die Tat umsetzen. In Bezug auf den vorgeschlagenen molekularen Gedächtnismechanismus liste ich hier 4 Mechanismen auf. Die 3 aktuellen Modelle in der Fachliteratur sind John Lisman: CaM-Kinase 2, Todd Sacktor: PKMzeta, und Eric Kandel, ein anderer Nobelpreisträger, der CEPB vorgeschlagen hat. Alle bis heute vorgeschlagenen Proteine befanden sich innerhalb des postsynaptischen Bereichs, während ich behaupte, dass wir sie außerhalb der Synapse suchen sollten. Sie weisen alle eine unterschiedliche synaptische Aktivierung auf. Und ich habe hier nicht die Zeit, darauf einzugehen. Aber damit sie sich selbst immer wieder und immer wieder kopieren können, müssen sie aufgrund der kurzen Halbwertzeit und der langfristigen Informationsspeicherung diese unterschiedlichen komplexen Mechanismen anregen. Die Essenz dieser Idee ist, dass ich ein Protein postuliere, das sich nicht kopieren muss, weil es sich nicht umsetzt. Und dies ist übrigens auch eine Erklärung für kritische Perioden, weil bis zu dem Zeitpunkt, wo die Proteine gebildet werden, nichts zur Speicherung vorhanden ist. Es ist keine Speicherung möglich, bis ein Labelling erfolgt und der Umsatz gestoppt wird. Die Literaturbelege für den proteolytischen Abbau … nun, wir haben dazu nichts beigetragen. Es gibt in der Literatur bereits Proteasen wie (gut geraten!) MMP9 (wie langweilig), die als Reaktion auf die synaptische Aktivität lokal translatiert und abgesondert werden. Die lokale Aufblähung von MMP9 auf Dornfortsätzen kann das Wachstum von Dornfortsätzen, ihre Vergrößerung und Potenzierung nachahmen. Hier sind ein paar Neuheiten zu sehen. Globale Disruption mit Chondroitinase. Die Verwendung einiger unterschiedlicher Enzyme des PNN kann kritische Perioden neu eröffnen. Nun, es ist oder war zumindest in der Literatur bekannt, dass die okulare Dominanzperiode bei einem Erwachsenen nicht verändert werden kann, es sei denn, man setzt dieses Enzym für einen kurzen Zeitraum ein, zerkleinert die alte extrazelluläre Matrix und ermöglicht es dem Tier, das synaptische… das PNN wiederherzustellen. Während dieser Periode kann man ihre Augen erneut untersuchen und die okularen Dominanzstreifen wiederherstellen. Und man vermutet schließlich, dass Inhibitoren die Potenzierung blockieren. Nun, ich weiß nicht, ob MMPs tatsächlich so wesentlich oder grundlegend sind, sie haben aber einfach die meisten Reagenzien, die man kaufen kann. Auch andere Enzyme können wichtig sein. Aber ich bin davon überzeugt, dass eine Kombination von Enzymen erforderlich ist. Wir wünschen uns natürlich, dass wir spezielle Erinnerungen direkt implantieren oder löschen könnten. Aber dazu müsste man wissen, wie das noch kompliziertere Problem… grundsätzlich funktioniert, nämlich wie die synaptische Aktivität Erfahrungen verschlüsselt. Aber das ist für uns ein zu großes Problem, ein gewaltiges Problem, um es zu lösen. Also beschränke ich mich auf die Beobachtung der stabilen Informationsspeicherung, die wir als Schreiben und Lesen kennen. Das ist das, was wir als Informationsspeicherung in nicht- flüchtigem Format bezeichnen. Und das ist wesentlich für die Stabilität und die Zivilisation. Deshalb gibt es einen Prozess des Schreibens und Lesens. Und deshalb versuchen wir nicht, uns auf die rein mündliche Übertragung von Generation zu Generation zu beschränken. Ich möchte anmerken, dass Sie sicherlich nicht denken, dass die Herstellung von Löchern eine gute Form der Speicherung ist. Aber bedenken Sie, dass die unkompliziertesten dauerhaften Speichermedien Medien wie Tontafeln oder Steingravuren oder selbst das Abreißen einer Eintrittskarte im Theater sind. Sie müssen unverzüglich und fälschungssicher nachweisen, dass Sie das Ticket benutzt haben. Das wird einfach abgerissen. Und das ist es dann… Da braucht es keinen komplizierten Mechanismus, man braucht nicht lernen, wie man schreibt, man braucht keine Stifte. Man reißt einfach ab. Natürlich stimmt das mit der klinischen Beobachtung überein, dass frühe Erinnerungen besser, oft besser erhalten bleiben als in jüngster Zeit gebildete Erinnerungen, was damit zu tun hat, dass daran jeweils ein anderes System beteiligt ist. Ich sage also nicht, dass dies der einzige Mechanismus ist, aber ich denke, er sollte ergänzend zu den traditionellen, traditionelleren intrasynaptischen Erinnerungen in Erwägung gezogen werden. Ich hoffe, Ihnen vermittelt haben zu können, dass die extrazelluläre Matrix auch ein vernachlässigtes Thema ist, das mehr Aufmerksamkeit verdient. Und wir haben immer gedacht, dass es so langweilig wäre. Dabei könnte es so interessant sein. Vielen Dank. Applaus.