Let me start out by saying how grateful I am to be here and have the privilege of addressing this wonderful gathering of students.
So I thank the Countess Bettina and the council for the opportunity to do so.
Now, when I was awarded the Nobel Prize in 1997, the Nobel Foundation asked me, as I’m sure they do all other laureates,
to write a brief autobiographical account and explain who are the major influences in life who had got me to Stockholm.
And I’ll start out by giving you one such example.
So, from 1972 to 1974 I was working away very happily at the Pasteur Institute in Paris in the laboratory of Georges Cohen.
And I was using skills that I’d developed in protein chemistry to study enzymes
that were involved in making the amino acid methionine.
And then I did something very faithful.
I wanted to extend my skills in protein chemistry.
And so I went to Cambridge on a course that was held there around Easter in 1974.
And at this meeting, at the dinner, I met this remarkable man, Frederick Sanger.
So Fred is one of 3 scientists who won 2 Nobel Prizes for chemistry, the other ones being Madame Curie and John Bardeen.
And of course Linus Pauling won one for chemistry and one for peace.
Fred’s first Prize as you can see was in 1958.
He sequenced the first protein, the insulin.
And the importance of this was not just that it was the first protein,
but it demonstrated that proteins had a defined sequence which some people doubted.
Although Fred said that he didn’t.
But the important corollary to this was that if it had a defined sequence, that information had to be stored somewhere.
And then his second Prize came in 1980, awarded jointly to Wally Gilbert and Paul Berg.
And Fred’s contribution was that he’d developed methods for sequencing DNA.
Now, when I went to work with him in 1974,
he was just developing those methods and applying them to the genome of the bacteriophage phiX174.
And actually Elizabeth Blackburn also participated in that effort as a PhD student.
And what Fred asked me to do was to sequence the proteins that were encoded in the genes that he was sequencing
because he wanted to be sure about the accuracy of his DNA sequencing methods.
And this was a way of checking that.
In retrospect it sounds banal but of course there was a huge pay off.
And that was that we discovered triple overlapping genes in those bacteriophages.
That is to say that all 3 phases of DNA were being used to encode different proteins.
This was mentioned by Hamilton Smith yesterday.
I still find it a very remarkable observation.
And really this set the course for the rest of my scientific life up to the present day.
And so the first lesson I have for young scientists is you should choose an excellent mentor as I did in Fred.
And as I’ve said, the reason that he was interested in me was because I had these skills in protein chemistry.
And according to my friends, I developed these skills at a very early age.
This is me reading this book, “The ABC of Protein Chemistry”.
Now, the next thing that Fred decided to do was to move to a somewhat larger genome
that’s found in the mitochondria of human cells.
So this is a modern depiction of mitochondria.
Here is the nucleus of the cell.
And what you can see is that the mitochondria extend throughout the cytoplasm.
And sometimes they’re in this fused state where they form a reticulum.
And at other stages they’re all in this fission state for example during apoptosis.
And there is a dynamic equilibrium between these 2 states.
And so this is rather different than the text book picture.
At least the text books that I read of the mitochondrion.
So they’re all joined into this dynamic reticulum.
And within each of these cells there can be up to 3 to 400 copies of mitochondrial DNA.
In a haploid cell there would be one set of nuclear genes but several hundred copies of mitochondrial DNA.
So the genome was sequenced.
It’s about 17 kilobases of circular double stranded DNA.
And again my task was to try to identify the protein genes that were... the genes encoding proteins in that genome.
There are 13 such proteins.
So the mitochondria contain about 2,000 different proteins in human cells
and only 13 of them are encoded in the mitochondrial genome.
The others are the products of nuclear genes.
And they’re imported into the organelle.
And also within this genome there are 2 genes that encode RNase, 16S RNA, 12S RNA
that become incorporated into the mitochondrial ribosomes
because the mitochondria have their own ribosomes, their own system for replication, transcription and translation.
And all of the proteins that go to assemble with these RNA molecules are coming from nuclear genes.
And then the other genes within this genome are 22 genes for tRNase.
These are represented by these circles.
And there are a minimal set that would translate the products of the mitochondrial genome.
And so the question was: What are the proteins?
And nothing was known at the beginning.
What was obvious was that all of these proteins were extremely hydrophobic.
And so I started looking in the inner membranes of mitochondria
and identified this cluster of genes here as encoding sub units 1, 2 and 3 of cytochrome oxidase
that Hartmut Michel talked about earlier this morning.
And then these 2 genes here which encode components of the ATPase complex that I’m going to talk about in a moment.
And actually these were another example, strangely enough, of overlapping genes.
And also from these studies on these proteins came verification of the modified genetic code that’s found in human mitochondria.
And then the other genes shown in green and blue were identified by other people, largely by Giuseppe Attardi at Caltech.
Now people had looked at the inner membranes of mitochondria,
where all of these 13 proteins were, in the 1960s using electron microscopy.
And negatively stained... That would negatively stained.
And what they could see was that the membranes were covered in structures -one pointed to here- that they called lollypops.
So there was a head and then the head was held to the membrane by a stick.
And it was an American biochemist called Efraim Racker who demonstrated that these were the ATP synthesising complexes
that were involved in generating ATP within the mitochondrion.
Now, Henri Matisse also knew about mitochondria.
The lady who showed us around the exhibition the other day had a different story but these are obviously mitochondrial membranes.
And these are ATP synthase complexes.
And here is a different view of the mitochondrion, of these lollypop structures taken more recently by a group in Groningen.
And what one can see here is that these lollypop structures are arranged in pairs.
And then the pairs of structures make long rows.
And we now know that these rows extend around the edges of the cristae of the mitochondria.
And actually it’s these assemblages that give the inner membranes of the mitochondria their highly invaginated structure.
And if you remove the capability of these complexes to dimerise, you lose the crystal structure inside the mitochondria.
So what I did then for the next 20 odd years was
to build up a structure of this complex at molecular level largely by x-ray crystallography.
Of course we had to identify the protein sequence, all of the protein sequence,
the genes, crystallise different parts and solve their structures by x-ray crystallography.
And this picture is actually based on more than 30 high resolution structures that we’ve solved over the years.
This part is the catalytic part where the ATP is being made.
You can see this interface opening and closing.
It opens and then the change between opening and closure is being driven by the rotation of this central shaft.
So here is the inner membrane of the mitochondrion.
And there’s a voltage across this membrane, sometimes referred to as the proton motive force.
Minus 200 millivolts.
And that voltage drives that rotation.
I’ll explain it in greater detail.
This part here is referred to as the peripheral stalk.
And it’s linking the external surface of the catalytic domain to this part down here.
So all of this is static, it’s the stator relative to the blue rotor.
And you’ll notice that whilst we’ve got exquisite details for most of this structure in this region here
that detailed information is missing.
And that has been my quest now for several years, was to get that information.
Because this is a critical part of the enzyme
because it’s in this interface between the green protein and the rotating ring that the rotary torque is somehow generated.
So what the enzyme is doing is to convert the voltage across the membrane into this rotary motion.
And the rotary motion then makes the catalytic part bind ADP and phosphate and turn it into ATP.
And each of you today will make 60 kilograms of ATP in your mitochondria by this process.
So it’s a massive process.
This is an extraordinarily efficient machine.
I’ve slowed down the rotation because it’s actually rotating between, somewhere between 500 and 1,000 times per second.
So it’s spewing out huge amounts of ATP inside your mitochondria.
Now, the structural characterisation was our contribution
but there are also important bio-physical experiments done in Japan by Kinosita, Yoshida and Noji.
So guided by structures we’d done, they build this, first of all built this chimera.
So here’s the catalytic part, upside down relative to the way I’ve been showing it.
And here’s the central part of the rotor.
And so what they did was to attach an actin filament from mouse skeletal muscle and then added ATP.
Now the filament is big enough to be seen in a fluorescence microscope.
They made the filament fluorescent and so they could observe the rotation.
And this was direct proof of the rotary mechanism that we suggested on the basis of looking at our structures.
And then in more recent manifestations of this experiment.
They’ve replaced the actin filament with gold beads.
And look how... This is drawn to scale.
Look how big the bead is relative to this little biological machine
but yet it’s able to turn this bead around, speeds approaching 150 per second.
So this is one of their experiments here.
This is the actin filament going around like a propeller.
And that rotation depends upon the hydrolysis of ATP.
So here in this experiment ATP is the fuel.
And one is looking at the back-hydrolytic reaction.
And in the synthetic sense when the enzyme is making ATP, the rotation is in the opposite sense.
It’s driven by the voltage of -200 millivolts across the inner membrane.
And so what about the problem of how to solve the rest of this structure?
And you’ve heard many wonderful talks over the past few days describing various structures
most of which have been solved by growing crystals of those proteins
and solving the structures to atomic resolution by x-ray crystallography.
But there is another method which is emerging
and in the next year or 2 you’re going to see some spectacular atomic level structures
coming out from this procedure of cryo-electron microscopy.
Now you heard an explanation of it earlier.
But I’ll go over it again.
So here in this top panel here there are particles of purified ATPase complexes
that have been frozen in vitreous ice in a hole in an electron microscope grid made of carbon.
And there is sufficient contrast that you can see these particles.
So what you do is you pick them, as depicted in these panels here, and then classify them into these different groups here.
So these are different views, different aspects of the ATPase complex.
And this particular group...
That peripheral stalk is on the left.
In this group here it’s on the right.
And in this group here it’s hidden around the back.
And so from this information you can build up a 3 dimensional model.
And you can...
With appropriate quality of information you can get to atomic resolution.
And this is a principle of it.
So here is this 3 dimensional duck at the top.
And what you’re doing is you’re recording different 2 dimensional views which you then turn into 2D Fourier transforms.
And then from this you can transform that into a 3D Fourier transform of the object.
And then you transform it back again.
And you’ve restored... You’ve solved the structure of the original image.
And so we applied this structure to the ATPase complex from 2010 to 2012
in collaboration with a former student John Rubinstein who is in Toronto.
We got these pictures here at 17 angstroms resolution.
It sounds modest but actually there’s a lot of information in it.
The part in the middle of course we already knew the atomic structure and the green part down the middle.
But these blue parts here were new.
This was new information.
At modest resolution but it was new information.
But it was an awful lot of work.
It took 2 years and one had to pick 60,000 of these particles by hand
and assemble them into classes and solve this structure in this way.
But there have been recent advances in cryo-electron microscopy
so that it’s now possible to determine atomic resolutions of protein complexes that are greater than 200 kDa.
And actually this number is being driven down to lower molecular weights all the time.
And the fact that it’s made... the difference is in the development of new detectors for electrons
that you associate with the electron microscope.
They’ve got increased. So they detect the electrons directly whereas the previous detectors
that were used detected the electrons indirectly.
The electrons made light and you detected the light.
And this has meant there’s been a big increase in signal to noise and much faster acquisition of data
so that you can now collect the images on a movie.
And this... Steven Chu referred to this point in his experiments yesterday.
And so by collecting the images so quickly you reduce one of the problems that blurred out the images that you are seeing,
namely the impact of the electrons on the protein complexes made them move.
But if you collect the images quickly then that is reduced.
And of course you reduce any possibility of mechanical motions that are coming from the movement of the microscope itself.
And concomitant with this of course as usual has come big improvements in computational methods.
And so just a few weeks ago we collected 10,000 particles from an ATP synthase from a fungus.
It’s a thermophilic fungus called Pichia angusta.
And in 2 weeks from start to finish after purifying the enzyme
as on the left collecting the images as in the middle we’d computed this image now at superior resolution
that had taken us 2 years in the past.
There’s much more detail in this structure.
We’ve not actually looked inside to interpret it because we know that by collecting more particles
So this is a very exciting development in structural biology and it is undoubtedly going to have a huge impact.
Now another thing that we’ve done over the years was to compare the mitochondrial enzymes
on which almost all the structural work is being done with bacterial complexes.
There’s much less structural work on bacterial ATPase complexes.
But you can see there’s a great deal in common.
There’s a common core. The catalytic parts are very similar.
The rotor rings are similar. But you’ll see that they have different numbers of C proteins in the ring.
This is not a constant. And that has important consequences.
There is an A protein that is actually providing the pathway for protons
to get through the membrane and is involved in the generation of rotation.
And then there’s a peripheral stalk in both cases but their compositions differ.
And the biggest difference is that in the mitochondrial enzymes there are 6 additional proteins in the membrane domain
which have got nothing whatever to do with making ATP but they turn out to have great significances.
I’ll show you towards the end of this talk.
So this is the way we think rotation is generated.
Here’s the A protein that we lack...
where we lack atomic resolution data.
And the idea that came from Wolfgang Junge is that there’s a half channel
that allows protons to access a negatively charged carboxyl group.
So there’s a negatively charged carboxyl in each of the C proteins that make the ring.
And in this model there are 12 C proteins in the ring.
And here the carboxyl is negatively charged.
The proton goes in through the half channel, neutralises it, makes it more hydrophobic
and therefore simply through Brownian motion the neutralised carboxyl
will move to this position here bringing another negative charge.
Another proton will go in and so you can see that as this happens in this stepwise fashion,
the protons get carried around the ring until they reach this site here
where it’s imagined that the properties of this part of the interface makes the carboxyl re-ionise,
re-generate the negative charge and now release the proton on the other side of the membrane through another half channel.
Now if there were 12 C proteins in this ring to generate a 360 degree rotation, you’d require 12 protons.
And since this rotor is attached to the stalk that I showed you earlier, the blue stalk
which turns around in the catalytic part and since the catalytic part contains 3 catalytic sites,
every time the rotor goes round you make 3 ATP molecules up here.
And therefore the cost in this case of making an ATP molecule would be 12.
The symmetry of the ring divided by 3.
So that would be 4 protons per ATP.
So it’s the ring symmetry divided by 3 that gives you this cost which is very important and central to bioenergetics.
This cost of making ATP molecules.
Now to everybody’s surprise it’s turned out that the different ATPases from different species have different ring symmetries.
And we now know from our own work that the ATPases in metazoans from man down to sponges,
porifera, have rings with 8-fold symmetry.
Yeast has 10-fold symmetry.
And then eubacteria -has been demonstrated largely in Frankfurt- the eubacterial rings have anything from 10 to 15-fold symmetry.
And then spinach chloroplast where there’s an ATPase complex has 14-fold symmetry.
And so from this you can deduce that the cost, the number of protons per ATP is 2.7 in metazoans
and it goes up to 3.3 in yeast and then up to 5 protons per ATP in some eubacteria.
So what does this mean? So, if you look at the structures of these rotor rings.
So they’re drawn to the same scale in cross section.
This is our human ring that’s been driven round requiring 2.7 protons to make each ATP.
And this is the one for example found in the cyanobacterium synechococcus.
It’s got 15-fold and this organism pays 5 protons to make each ATP.
So it’s less efficient than the metazoan machine.
And why has this situation evolved.
Well, we think it’s because that in the metazoan mitochondria there is this very large membrane potential, minus 200 millivolts,
which can drive the ring whereas these organisms live in relatively impoverished energetic circumstances.
They generate a lower membrane potential.
And so the cost they have to pay then is to drive a bigger ring around in order to make 3 ATP molecules.
So this is a low gear in the machine and this is a high gear.
And this is the highest gear that is being observed.
I think it will be the highest gear that exists in biology.
So that’s one way in which ATPases differ between man and bacteria.
And the reason we’re interested to know this is we think that the ATPase complex
is actually a very good target for developing new antibiotics and new drugs.
And one of my students, Alice Zong is here in the audience.
And she has solved the structure of the enzyme from mycobacterium smegmatis
in order to be able to develop new drugs to combat tuberculosis.
Now, another way in which they differ, the bacterial and human enzymes, is in the way they’re regulated.
And I’ll just talk about the regulation of the mitochondrial enzymes.
But first I need to tell you that whilst, as you’re familiar, many proteins of course are structured,
they have alpha helices, beta sheets and so forth.
But there’s another class of proteins that has come to the fore in the past few years.
And these are intrinsically disordered proteins.
So you find them. And they have no secondary structure.
And they have common features.
They’re often heat-stable, have a large number of charge residues, a few bulky residues.
Many of them are involved in regulatory mechanisms.
And often they will bind to more than one partner.
That is to say they can form more than one structure depending upon which protein they’re interacting with.
And it turns out that the inhibitory region of the regulatory protein for the ATPase
And this protein is heat-stable. A large number of charge residues. A few bulky residues.
It’s predicted to be disordered and most importantly its nuclear magnetic resonance spectrum demonstrates
that indeed it is a disordered protein.
Now, this realisation was somewhat surprising because some years ago
we’d solved a structure of the inhibitor protein bound in the ATPase complex.
So this is the blue rotor in the middle here.
And this is an interface, one of the 3 catalytic interfaces.
And this alpha helix you can see here has inserted itself in this interface and has stopped the machine dead.
So it’s rather like sticking a stick in a rotating bicycle wheel.
You put the stick in, rotation stops.
And that’s what happens with the ATPase.
And in order to form this inhibitor complex you have to hydrolyse 2 ATP molecules.
So the idea was or is that under conditions of anoxia, for example during an ischemic heart attack,
that the proton motive force would become dissipated because of the onset of glycolysis.
This would then make the enzyme to start to run backwards.
It would destroy the ATP that had been made.
But this protein becomes activated by a mechanism. I won’t describe.
It’s normally quiescent.
And then intervenes and stops the back reaction.
And then if you restore the proton motive force, put it back under conditions
where there’s oxygen, the rotation goes in the opposite sense and the inhibitor is removed.
So this has remarkable property from an enzyme point of view of being a unidirectional inhibitor.
It only inhibits ATP hydrolysis and not synthesis.
Now what we’ve just done is we’ve managed to solve structures where we had 3 inhibitor proteins bound to the complex.
We had very large excesses of inhibitors with specific mutations that I won’t describe.
And what we could see...
So if you imagine that the inhibitor protein is completely disordered in free solution,
it then starts to bind to the ATPase complex through the most open of those 3 catalytic interfaces,
through the so called empty E interface.
And then this little nucleus of an alpha helix starts to form.
The rotor then rotates through 120 degree step driven by the hydrolysis of the first ATP. The site closes.
You can see that the aspect that you’re looking at, that the rotor has changed.
And now the helix can elongate itself and forms a somewhat longer helix.
And then there’s another 120 degree step, the rotation of the rotor driven by hydrolysis of the second ATP.
And now the inhibitor can extend its structure to the one that we’d observed in the past.
So this is a very nice observation which was unexpected in many people’s minds
that one would be able to observe folding intermediates of intrinsically inhibitor proteins by x-ray crystallography.
And this is... This paper was accepted yesterday by the PNAS.
Now I want to tell you about another extremely important way of uncoupling the ATPase.
And this is via something called the permeability transition pore.
So the phenomenon of the permeability transition has been known for more than 30 years.
But there was no molecular explanation. So let me explain.
So on the left... Don’t bother about the left.
This is a depiction of apoptosis which is familiar to you leading to cell death.
On the right is a depiction of how people think necrosis, another form of cell death, is triggered.
So the idea is that calcium is released in response to various stresses.
It could be reactive oxygen.
It could be a variety of things.
So oxygen in this case... calcium ions are being released from the endoplasmic reticulum into the cytoplasm.
And under those conditions the calcium ions are rapidly taken up by proteins
in the inner membranes of mitochondria into the matrix of the mitochondria.
And this influx of large amounts of calcium has the effect of opening a pore
which is called the mitochondrial permeability transition pore.
And it’s regulated by a protein that Kurt Wüthrich mentioned yesterday, cyclophilin D to which cyclosporine A binds.
So cyclosporine A actually prevents the opening of this channel.
And then what happens is that this channel, which is a big, big channel, it’s said to release molecules up to 1.5 kDa.
This disgorges the contents of the matrix of the mitochondria.
Water rushes in. The mitochondria swell and then they burst.
And then this triggers this cell death process by necrosis.
So that those phenomena are well studied and well known.
And the question has been: What is the mitochondria permeability transition pore?
So you can look at this review in Nature 2 or 3 years ago
and what it tells you is that the permeability transition pore is made of a dimer of a transport protein.
It’s called that adenine nucleotide transporter.
What it’s doing is to remove the ATP made in the matrix
and take it outside to make it available to the rest of the cell and bring back ADP.
So according to this model the channel is composed of 2 of those proteins and 2 other proteins in the outer membrane
that are called the voltage dependent anion channel.
And this is completely wrong.
Because the permeability transition pore actually resides within the membrane domain of the ATPase complex.
So what we’ve done over the past 18 months using RNAi in human cells,
is to eradicate each of the proteins in the peripheral stalk, each of these proteins,
the C proteins then by another means, I won’t explain, the A proteins and also the gamma proteins.
We’ve done each of these one at a time and looked to see what was the impact on the opening of the permeability transition pore.
Removing this protein had no effect, this had no effect, this had no effect, this had no effect, no effect, no effect.
But the ones that were important were e, f, g, DAPIT 6.8 proteolipid and B.
And so these are the so called supernumerary proteins.
Each of them appears to have one transmembrane helix.
We don’t actually know how many copies of each there are.
But we’re determining that at the moment.
We don’t know which way round they are.
Is it N-terminus in or out. But anyway the suppression of any one of them abolishes this permeability transition.
But we’re still not able to say precisely what makes the pore
because when you suppress E you also lose G from the ATPase complex and vice versa.
And there are similar relationships between these 2 proteins.
So we can’t right now say exactly what it is.
And so our conclusions is that those proteins are involved and A and C are not.
And what we’ll do is now determine the precise structure of this pore.
We’ll find inhibitors which have got tremendous medical potential.
And so my pursuing this enzyme complex for now 35 years has provided some more lessons for young scientists.
You need to choose your topic well.
You’ll definitely need stamina if you’re going to solve a problem like this.
And of course everybody needs some luck.
And then you may eventually end up in Stockholm as we did in 1997.
So this is Paul Boyer, Jens Skou and myself, the chemistry recipients.
And if you look carefully, you’ll see here on the left is Steven Chu receiving his physics prize.
So thank you very much.
Applause
Zunächst möchte ich zum Ausdruck bringen, wie dankbar ich bin,
hier sein zu dürfen und vor diesen wunderbaren Studenten sprechen zu können.
Ich danke Gräfin Bettina und dem Kuratorium für diese Gelegenheit.
Als ich 1997 den Nobelpreis erhielt, bat mich die Nobel-Stiftung wie wohl jeden anderen Preisträger auch,
ein kurzes autobiographisches Profil über mich zu schreiben und zu erläutern,
welche wesentlichen Einflüsse im Leben mich letztendlich nach Stockholm geführt haben.
Und ich möchte hier beginnen, indem ich Ihnen eines dieser Beispiele erzähle.
Von 1972 bis 1974 arbeitete ich mit Freude am Institut Pasteur in Paris im Labor von George Cohen.
Und ich nutzte dort meine auf dem Gebiet der Proteinchemie erworbenen Fähigkeiten für die Untersuchung von Enzymen,
die an der Bildung der Aminosäure Methionin beteiligt sind.
Und dann wollte ich etwas sehr Traditionsverbundenes machen,
nämlich meine Kenntnisse in der Proteinchemie verbessern und besuchte deshalb ein Seminar in Cambridge,
das um Ostern 1974 herum stattfand.
Und bei dieser Gelegenheit traf ich bei einem Abendessen diesen bemerkenswerten Herrn, Frederick Sanger.
Fred ist einer von drei Forschern, die zwei Nobelpreise für Chemie erhalten haben.
Die beiden anderen sind Madame Curie und John Bardeen.
Und Linus Pauling erhielt einen Nobelpreis für Chemie und einen Friedensnobelpreis.
Seinen ersten Preis konnte Fred, wie Sie hier sehen, 1958 entgegen nehmen.
Er hatte das erste Protein, Insulin, sequenziert.
Und das war nicht nur deshalb so bedeutend, weil es das erste Protein war, sondern weil damit nachgewiesen wurde,
dass Proteine eine definierte Sequenz aufweisen, was einige Wissenschaftler bezweifelt hatten.
Fred hatte, wie er sagte, nie daran gezweifelt.
Die logische Folge war aber auch,
dass – sofern es denn eine definierte Sequenz gäbe – diese Informationen irgendwo gespeichert werden mussten.
Seinen zweiten Nobelpreis erhielt er 1980 gemeinsam mit Wally Gilbert und Paul Berg
und sein Beitrag bestand aus der Entwicklung von Methoden zur DNA-Sequenzierung.
Als ich 1974 bei ihm anfing zu arbeiten, entwickelte er diese Methoden gerade
und setzte sie am Genom des Bakteriophagen phiX174 ein.
Auch Elizabeth Blackburn war als Doktorandin an diesen Arbeiten beteiligt.
Fred bat mich, die in den Genen kodierten Proteine zu sequenzieren, weil das eine Möglichkeit war,
die Genauigkeit seiner DNA-Sequenzierungsmethode zu überprüfen.
Rückblickend mag das banal klingen, aber natürlich hat sich das enorm ausgezahlt,
denn wir entdeckten dabei in diesen Bakteriophagen dreifach überlappende Gene.
Und das bedeutete also, dass alle drei DNA-Phasen zur Kodierung verschiedener Proteine verwendet wurden.
Hamilton Smith hat das gestern erwähnt.
Ich finde das nach wie vor eine sehr bemerkenswerte Beobachtung.
Und sicherlich wurden damals auch die Weichen für meine wissenschaftliche Zukunft bis zum heutigen Tage gestellt.
Meine erste Lektion für Sie als junge Wissenschaftler lautet deshalb,
dass Sie sich einen ausgezeichneten Mentor suchen sollten, wie ich ihn in Fred gefunden habe.
Und wie ich bereits sagte, war ich für ihn interessant, weil ich diese Fähigkeiten in der Proteinchemie mitbrachte.
Und wenn ich meinen Freunden glauben darf, habe ich diese Fähigkeiten bereits sehr früh entwickelt.
Hier sehen Sie mich beim Lesen des Buches „The ABC of Protein Chemistry“.
Als Nächstes wollte sich Fred einem etwas größeren Genom zuwenden,
das in den Mitochondrien von menschlichen Zellen zu finden ist.
Das hier ist eine moderne Abbildung von Mitochondrien.
Hier ist der Kern der Zelle.
Sie sehen, dass die Mitochondrien über das Cytoplasma hinausreichen.
Und zum Teil sind sie in diesem verschmolzenen Zustand, in dem sie ein Retikulum bilden.
Und in anderen Phasen sind sie in diesem Teilungszustand, beispielsweise während der Apoptose.
Und zwischen diesen beiden Zuständen besteht ein dynamisches Gleichgewicht.
Das sieht doch ganz anders aus als das, was die Bilder in Lehrbüchern zeigen,
zumindest den Lehrbüchern, die ich über das Mitochondrium gelesen habe.
Sie sind alle zu diesem dynamischen Retikulum verbunden.
Und innerhalb dieser Zellen können sich bis zu 300 oder 400 Kopien der mitochondrialen DNA befinden.
Und in einer haploiden Zelle würde sich ein einziger Satz an nuklearen Genen befinden,
aber mehrere hundert Kopien der mitochondrialen DNA.
Das Genom wurde also sequenziert.
Es hat rund 17 Kilobasen zirkulärer doppelsträngiger DNA.
Und erneut war es meine Aufgabe, die Protein-Gene zu identifizieren, die …
die Gene, die in diesem Genom Proteine kodieren.
Es gibt 13 solcher Proteine.
Die Mitochondrien menschlicher Zellen enthalten also rund 2.000 verschiedene Proteine
und nur 13 davon sind im mitochondrialen Genom kodiert.
Die anderen sind die Produkte nuklearer Gene.
Und die werden in die Organelle eingeschleust.
In diesem Genom gibt es auch zwei Gene, die RNase, 16S RNA, 12S RNA kodieren,
die in die mitochondrialen Ribosome eingeschleust werden.
Denn die Mitochondrien haben ihre eigenen Ribosome, ihr eigenes Replikations-, Transkriptions- und Translationssystem.
Und alle Proteine, die sich dann mit diesen RNA-Molekülen zusammenschließen, stammen aus den nuklearen Genen.
Die anderen Gene innerhalb dieses Genoms sind 22 Gene für tRNase.
Sie werden durch diese Kreise repräsentiert.
Und es gibt einen minimalen Satz, der die Produkte des mitochondrialen Genoms translatiert.
Die Frage war also: Welche Proteine sind es?
Und zunächst wusste man überhaupt nichts.
Offensichtlich war nur, dass diese Proteine alle extrem hydrophob waren.
Und so begann ich damit, die Innenmembranen von Mitochondrien zu untersuchen
und identifizierte diese Gruppe von Genen als kodierende Untereinheiten 1, 2 und 3 der Cytochrom-Oxidase,
über die Hartmut Michel heute Vormittag gesprochen hat.
Und später diese beiden Gene hier, die Bestandteile des ATPase-Komplexes kodieren, über den ich gleich noch sprechen werde.
Und tatsächlich waren sie, seltsam genug, ein weiteres Beispiel für überlappende Gene.
Und durch die Untersuchung dieser Proteine konnte auch der modifizierte genetische Code verifiziert werden,
der in Mitochondrien zu finden ist.
Die anderen Gene, die hier in Grün und Blau gekennzeichnet sind, wurden von anderen identifiziert,
größtenteils von Giuseppe Attardi am Caltech.
In den 1960er Jahren hatten Forscher mithilfe der Elektronenmikroskopie die Innenmembranen von Mitochondrien untersucht,
wo sich diese 13 Proteine alle befinden.
Und das wurde negativ gefärbt … negativ gefärbt.
Und so konnten sie erkennen,
dass die Membranen in Strukturen eingehüllt waren - eine ist hier zu sehen - die sie Lollypops nannten.
Es gab also einen Kopf und der Kopf wurde mit einem Stift an der Membran festgehalten.
Der amerikanische Biochemiker Efraim Racker wies nach,
dass es sich hierbei um die ATP-synthetisierenden Komplexe handelte,
die an der Erzeugung von ATP im Mitochondrium beteiligt sind.
Nun, auch Henri Matisse kannte schon Mitochondrien.
Die Dame, die uns dieser Tage durch die Ausstellung geführt hat, hat eine andere Geschichte dazu erzählt.
Aber dies sind ganz offensichtlich Mitochondrienmembranen.
Und das hier sind ATP-Synthase-Komplexe.
Und das hier ist ein anderes Bild des Mitochondriums, dieser lollypop-artigen Strukturen.
Es wurde kürzlich von einer Gruppe in Groningen erstellt.
Und hier sieht man, dass diese Lollypop-Strukturen in Paaren angeordnet sind.
Die Strukturpaare bilden lange Reihen.
Und heute wissen wir, dass sich diese Reihen um die Ränder der mitochondrialen Cristae herum ausdehnen.
Und genau diese Verbundstrukturen geben den Innenmembranen der Mitochondrien ihre stark eingestülpte Form.
Wenn man die Dimerisierungsfähigkeit dieser Komplexe entfernt, geht die Kristallstruktur im Innern der Mitochondrien verloren.
Die nächsten 20 Jahre habe ich mich dann damit beschäftigt,
eine Struktur dieses Komplexes auf Molekülebene zu entwickeln, größtenteils durch Röntgenkristallographie.
Und natürlich mussten wir die Proteinsequenz identifizieren, die gesamte Proteinsequenz, die Gene,
verschiedene Teile kristallisieren und ihre Strukturen mit Röntgenkristallographie aufklären.
Dieses Bild hier basiert auf mehr als 30 hochauflösenden Strukturen, die wir im Laufe der Jahre aufgeklärt haben.
Das hier ist der katalytische Teil, wo das ATP erzeugt wird.
Sie sehen, wie sich diese Übergangsstelle öffnet und schließt.
Sie öffnet sich und dann wird der Wechsel zwischen Öffnen und Schließen durch die Rotation dieser zentralen Achse gesteuert.
Das hier ist die Innenmembran des Mitochondriums.
Und durch diese Membran fließt eine Spannung, die manchmal als Protonengradient bezeichnet wird.
Minus 200 Millivolt.
Diese Spannung sorgt für die Rotation.
Ich will das noch detaillierter erläutern.
Das hier ist die periphere Verbindungsachse.
Und sie verbindet die Außenfläche der katalytischen Domäne mit diesem Teil hier unten.
Und das alles hier ist statisch.
Das ist der Stator im Verhältnis zum blauen Rotor.
Und Sie werden bemerkt haben, dass wir zwar ausgezeichnete Details für den Großteil dieser Struktur in dieser Region hier haben,
hier diese Detailinformationen aber fehlen.
Und seit mehreren Jahren ist es mein Bestreben, diese Informationen zu erhalten.
Denn dies ist ein entscheidender Teil des Enzyms,
da an dieser Schnittstelle zwischen dem grünen Protein und den Rotationsringen in irgendeiner Weise das Drehmoment erzeugt wird.
Das Enzym wandelt also die durch die Membran fließende Spannung in diese Drehbewegung um.
Und die Drehbewegung sorgt dafür, dass der katalytische Teil ADP und Phosphat bindet und in ATP umwandelt.
Und jeder von Ihnen wird heute über diesen Prozess 60 Kilogramm ATP in seinen Mitochondrien erzeugen.
Das ist also wirklich ein gewaltiger Prozess.
Das ist eine außerordentlich effiziente Maschine.
Ich habe die Umdrehung verlangsamt.
In Wirklichkeit liegt sie irgendwo zwischen 500 und 1000 Mal pro Sekunde.
Da wird also eine riesige Menge ATP in Ihren Mitochondrien ausgespuckt.
Unser Beitrag war also die strukturelle Charakterisierung.
Aber es wurden auch bedeutende biophysikalische Experimente von Kinosita, Yoshida und Noji in Japan durchgeführt.
Mithilfe der von uns aufgeklärten Strukturen haben sie zunächst diese Chimäre entwickelt.
Das hier ist der katalytische Teil, genau umgekehrt zu dem, was ich Ihnen gezeigt habe.
Und hier ist der zentrale Teil des Rotors.
Diese Wissenschaftler haben ein Aktinfilament aus dem Skelettmuskel der Maus befestigt und dann ATP zugegeben.
Das Filament ist groß genug, um es in einem Fluoreszenzmikroskop zu erkennen.
Sie haben das Filament fluoresziert und konnten so die Rotation beobachten.
Und das war der direkte Nachweis des Rotationsmechanismus,
den wir auf der Grundlage der Analyse unserer Strukturen vermutet hatten.
Und später haben sie in jüngeren Varianten dieses Experiments das Aktinfilament durch Goldkügelchen ersetzt.
Und hier sehen Sie wie … das hier ist maßstabsgetreu.
Sehen Sie, wie groß das Kügelchen im Verhältnis zu dieser kleinen biologischen Maschine ist.
Aber die kann dieses Kügelchen mit Geschwindigkeiten von rund 150 pro Sekunde drehen.
Das hier ist eines ihrer Experimente.
Dies ist das Aktinfilament, das wie ein Propeller rotiert.
Und diese Rotation hängt von der ATP-Hydrolyse ab.
In diesem Experiment ist ATP der Treibstoff.
Und man beobachtet die hydrolytische Rückkopplung.
Im synthetischen Sinne erfolgt die Rotation entgegengesetzt, wenn das Enzym ATP erzeugt.
Und das wird durch die Spannung von -200 Millivolt quer durch die Innenmembran gesteuert.
Wie sieht es nun mit der Aufklärung der restlichen Struktur aus?
Sie haben in den letzten Tagen viele wunderbare Vorträge gehört, in denen verschiedene Strukturen beschrieben wurden,
die größtenteils durch die Züchtung von Kristallen solcher Proteine
und die Darstellung der Strukturen in atomarer Auflösung durch Röntgenkristallographie beschrieben wurden.
Derzeit etabliert sich eine weitere Methode
und in den nächsten ein oder zwei Jahren
werden wir wahrscheinlich einige spektakuläre Strukturen auf atomarer Ebene zu sehen bekommen,
die mit Hilfe dieses Verfahrens, der Kryo-Elektronenmikroskopie, möglich werden.
Sie haben eine Erklärung darüber gehört.
Aber ich möchte das noch einmal wiederholen.
Hier in diesem oberen Teil gibt es Partikel gereinigter ATPase-Komplexe,
die in einer Öffnung eines Elektronenmikroskopgitters aus Kohlenstoff in Glaseis eingefroren wurden.
Und der Kontrast reicht aus, diese Partikel zu erkennen.
Dann nimmt man sie, wie in diesen Feldern hier abgebildet, und klassifiziert sie in diese verschiedenen Gruppen hier.
Das hier sind also unterschiedliche Ansichten, unterschiedliche Aspekte des ATPase-Komplexes.
Und diese spezielle Gruppe … diese periphere Verbindungsachse befindet sich links.
Und diese Gruppe hier befindet sich rechts.
Und diese Gruppe hier ist hinter der Rückseite versteckt.
Aus diesen Informationen kann man ein dreidimensionales Modell erstellen.
Und man kann … und mit ausreichend hochwertigen Informationen erreicht man atomare Auflösung.
Und so funktioniert das: Hier oben sehen Sie die dreidimensionale Ente.
Man erfasst unterschiedliche zweidimensionale Ansichten, die man dann in 2D-Fourier transformiert.
Und das kann man dann in eine 3D-Fourier-Transformation des Objektes umwandeln.
Und dann erfolgt eine Rückumwandlung.
Und so hat man die Struktur des Originalbildes aufgeklärt.
Wir haben diese Struktur von 2010 bis 2012 in Zusammenarbeit mit einem früheren Studenten, John Rubinstein,
der in Toronto ist, auf den ATPase-Komplex angewandt.
Und daraus sind diese Aufnahmen mit einer Auflösung von 17 Angström entstanden.
Das mag bescheiden klingen, enthält aber in Wirklichkeit eine Menge Informationen.
Den mittleren Teil kannten wir natürlich, die Atomstruktur und den grünen Teil unterhalb der Mitte auch.
Aber diese blauen Teile hier waren neu.
Das waren neue Informationen.
Zwar bei bescheidener Auflösung, aber es waren neue Informationen.
Und das war unglaublich viel Arbeit.
Das hat zwei Jahre gedauert.
Dazu musste man 60.000 dieser Partikel manuell aufnehmen und sie in Klassen zusammenführen
und diese Struktur auf diese Art und Weise aufklären.
Aber jetzt gibt es Fortschritte in der Kryo-Elektronenmikroskopie.
Jetzt ist es möglich, atomare Auflösungen von Protein-Komplexen mit über 200 kDa zu ermitteln.
Und diese Zahl wird ständig auf noch geringere Molekulargewichte heruntergedrückt.
Und die Tatsache, dass … der Unterschied liegt in der Entwicklung neuer Detektoren für Elektronen,
mit denen man im Elektronenmikroskop zu tun hat.
Sie sind besser geworden.
Sie entdecken die Elektronen direkt, während die früher eingesetzten Detektoren die Elektronen indirekt erkannten.
Die Elektronen erzeugten Licht und man entdeckte das Licht.
Und dies hat zur Folge, dass man inzwischen ein wesentlich besseres Signal-Rausch-Verhältnis erreicht hat
und eine viel schnellere Datenerfassung möglich wurde, sodass man die Bilder in einem Film erfassen kann.
Und…Steven Chu hat darauf in seinen Experimenten Bezug genommen, von denen er gestern berichtete.
Durch eine derartig schnelle Erfassung der Bilder reduziert man das Problem, das die Bilder so unscharf erscheinen ließ,
nämlich den Einfluss der Elektronen auf die Proteinen-Komplexe, der sie in Bewegung setzte.
Wenn man die Bilder schnell macht, wird dieser Effekt reduziert.
Und natürlich reduziert man die Möglichkeit mechanischer Bewegungen, die aus der Bewegung des Mikroskops selbst stammen.
Und gleichzeitig sind, wie üblich, weitere große Verbesserungen in den computergestützten Berechnungsmethoden möglich geworden.
Und so haben wir vor einigen Wochen 10.000 Partikel aus einer ATP-Synthase von einem Pilz erfasst.
Es handelt sich um einen thermophilen Pilz mit der Bezeichnung Pichia angusta.
Und innerhalb von insgesamt nur zwei Wochen konnten wir nach Reinigung des Enzyms, wie links zu sehen,
der Erfassung der Bilder, wie in der Mitte zu sehen, dieses Bild mit einer hervorragenden Auflösung computergestützt erstellen.
Dafür hätten wir früher zwei Jahre gebraucht.
Und wir haben wesentlich mehr Details in dieser Struktur.
Das Innere haben wir bisher noch nicht analysiert und interpretiert,
weil wir wissen, dass wir durch die Erfassung von noch mehr Partikeln – und das geschieht momentan –
das Ganze in einer noch viel höheren Auflösung erhalten.
Und das ist eine wirklich aufregende Entwicklung in der Strukturbiologie und das wird unzweifelhaft enorme Auswirkungen haben.
Etwas anderes, was wir im Laufe der Jahre gemacht haben, war der Vergleich der mitochondrialen Enzyme,
über die fast die gesamte strukturelle Arbeit erfolgt ist, mit bakteriellen Komplexen.
Es gibt viel weniger Strukturarbeit zu bakteriellen ATPase-Komplexen.
Aber man sieht, dass sie vieles gemein haben.
Es gibt einen Kern.
Die katalytischen Teile sind sehr ähnlich.
Die Rotorringe sind ähnlich.
Aber, wie Sie sehen, weisen sie unterschiedliche Zahlen von C-Proteinen im Ring auf.
Das ist keine Konstante.
Und das hat bedeutende Konsequenzen.
Ein A-Protein liefert den Signalweg für Protonen durch die Membran und ist an der Erzeugung der Drehbewegung beteiligt.
Und in beiden Fällen gibt es eine periphere Verbindungsachse, deren Zusammensetzung sich aber unterscheidet.
Der größte Unterschied ist, dass in den mitochondrialen Enzymen sechs zusätzliche Proteine in der Membrandomäne vorhanden sind,
die nichts mit der Bildung von ATP zu tun haben, aber von großer Bedeutung zu sein scheinen.
Das werde ich Ihnen am Ende dieses Vortrags erläutern.
So wird nach unserer Kenntnis die Rotation erzeugt.
Hier ist das A-Protein, für das uns atomare Auflösungsdaten fehlen.
Wolfgang Junge hatte die Idee, dass es einen Halbkanal gibt,
der den Protonen den Zugang zu einer negativ geladenen Carboxyl-Gruppe ermöglicht.
Es gibt in jedem der C-Proteine, die den Ring bilden, ein negativ geladenes Carboxyl.
Und in diesem Modell befinden sich 12 C-Proteine im Ring.
Und hier ist das Carboxyl negativ geladen.
Das Proton tritt über den Halbkanal ein, neutralisiert es, macht es hydrophober
und deshalb bewegt sich das neutralisierte Carboxyl einfach durch die Brownsche Bewegung in diese Position
und sorgt für eine weitere negative Ladung.
Ein weiteres Proton dringt ein und durch dieses schrittweise ablaufende Muster werden die Protonen um den Ring transportiert,
bis sie diese hier abgebildete Stelle erreichen, wo die Eigenschaften dieses Teils der Übergangsstelle dafür sorgen,
dass das Carboxyl reionisiert, die negative Ladung regeneriert
und das Proton auf der anderen Seite der Membran über die andere Kanalhälfte freigesetzt wird.
Wenn es in diesem Ring 12 C-Proteine gäbe, die eine 360-Grad-Rotation erzeugen, bräuchte man 12 Protonen.
Und da dieser Rotor an der Verbindungsachse befestigt ist, die ich Ihnen bereits zeigte, die blaue Verbindungsachse,
die sich im katalytischen Teil dreht, und da der katalytische Teil drei katalytische Stellen umfasst,
werden bei jeder Rotorumdrehung hier oben drei ATP-Moleküle erzeugt.
Und deshalb würde man in diesem Fall für die Erzeugung eines ATP-Moleküls 12 benötigen.
Die Symmetrie des Rings, geteilt durch 3.
Das wären 4 Protonen pro ATP.
Es ist also diese Ringsymmetrie, geteilt durch 3, die den Aufwand ergibt.
Der spielt für die Bioenergetik eine sehr bedeutende und zentrale Rolle, dieser Aufwand für die Erzeugung von ATP-Molekülen.
Für alle war es dann eine Riesenüberraschung, als sich herausstellte,
dass die unterschiedlichen ATPasen von unterschiedlichen Spezies unterschiedliche Ringsymmetrien aufweisen.
Und wir wissen aus unserer Arbeit,
dass die ATPasen in Metazoen von Menschen bis hinunter zu Schwämmen, Porifera, Ringe mit 8-facher Symmetrie aufweisen.
Hefe hat die 10-fache Symmetrie.
Und die Eubakterien,
die eubakteriellen Ringe – wie größtenteils in Frankfurt nachgewiesen – haben eine 10- bis 15-fache Symmetrie.
Und der Spinat-Chloroplast hat einen ATPase-Komplex mit 14-facher Symmetrie.
Und daraus kann man ableiten, dass der Aufwand, also die Anzahl der Protonen pro ATP, in Metazoen bei 2,7 liegt
und in Hefe bis zu 3,3 hochgeht und dann bis zu 5 Protonen per ATP in einigen Eubakterien.
Was bedeutet das?
Wenn man die Strukturen dieser Rotorringe betrachtet … sie sind im selben Maßstab im Querschnitt dargestellt...
Dies ist unser menschlicher Ring, der rotiert und 2,7 Protonen für die Herstellung jedes ATP benötigt.
Und das hier ist beispielsweise ein Ring, der im Cyanobacterium Synechococcus gefunden wurde.
Der hat die 15-fache Symmetrie.
Dieser Organismus braucht 5 Protonen für jedes ATP.
Er ist also wesentlich ineffizienter als die metazoische Maschine.
Und warum hat sich dieser Situation so entwickelt?
Wir denken, dass hängt damit zusammen, dass es in den metazoischen Mitochondrien dieses sehr großes Membranpotenzial gibt,
minus 200 Millivolt, das diesen Ring antreiben kann,
während diese Organismen unter relativ ärmlichen energetischen Umständen leben.
Sie erzeugen ein geringeres Membranpotenzial.
Und deshalb besteht der Preis, den sie zu zahlen haben, in der Umdrehung eines größeren Rings, um 3 ATP-Moleküle zu bilden.
Diese Maschine fährt also in einem niedrigen Gang und diese in einem hohen Gang.
Und das hier ist der höchste beobachtete Gang.
Ich denke, es ist der höchste Gang, der in der Biologie existiert.
Das ist ein Aspekt, in dem sich die ATPasen von Menschen und Bakterien unterscheiden.
Und wir wollen das herausfinden,
weil der ATPase-Komplex tatsächlich eine sehr gute Target-Struktur für die Entwicklung neuer Antibiotika
und neuer Arzneimittel sein dürfte.
Alice Zong, eine Studentin von mir, sitzt im Publikum.
Sie hat die Enzymstruktur des Mycobacterium Smegmatis aufgeklärt,
um neue Medikamente zur Bekämpfung der Tuberkulose entwickeln zu können.
Eine weitere Weise, in der sich bakterielle und menschliche Enzyme voneinander unterscheiden,
ist die Art ihrer Regulierung.
Und ich rede nur über die Regulierung der mitochondrialen Enzyme.
Aber zunächst muss ich sagen, dass sicherlich viele Proteine strukturiert sind.
Sie haben Alpha-Helices, Beta-Faltblätter usw.
Aber es gibt eine weitere Klasse von Proteinen, die in den letzten Jahren in den Vordergrund getreten ist.
Und das sind intrinsisch ungeordnete Proteine.
Die gibt es.
Und die haben keine sekundäre Struktur.
Und sie weisen gemeinsame Merkmale auf.
Sie sind oft hitzestabil, haben eine große Zahl an Ladungsresten, einige massive Reste.
Viele von ihnen sind an Regulierungsmechanismen beteiligt.
Und oft binden sie an mehr als einen Partner.
Sie können also mehr als eine Struktur bilden, abhängig davon, mit welchem Protein sie interagieren.
Und es hat sich herausgestellt,
dass die inhibitorische Region des regulierenden Proteins für die ATPase – sie wird als Inhibitor von F1 ATPase, IF1 bezeichnet –
intrinsisch ungeordnet ist.
Und dieses Protein ist hitzestabil, hat eine riesige Zahl von Ladungsresten.
Einige massive Reste.
Seine Unordnung ist vorhersagbar und was am wichtigsten ist:
Sein kernmagnetisches Resonanzspektrum zeigt, dass es sich in der Tat um ein ungeordnetes Protein handelt.
Das war ziemlich überraschend, weil wir einige Jahre vorher eine Struktur des Inhibitor-Proteins aufgeklärt hatten,
das im ATPase-Komplex gebunden ist.
Das ist der blaue Rotor hier in der Mitte.
Und das ist eine Schnittstelle, eine der drei katalytischen Schnittstellen.
Und diese Alpha-Helix, die Sie hier sehen, hat sich selbst an dieser Schnittstelle eingefügt und die Maschine gestoppt.
Das kann man sich so vorstellen, als wenn man einen Stock zwischen die Speichen eines sich bewegenden Fahrrades hält.
Man steckt den Stock herein, die Drehung stoppt.
Und genau das passiert mit der ATPase.
Und um diesen Inhibitor-Komplex zu bilden, muss man 2 ATP-Moleküle hydrolysieren.
Die Theorie war oder ist, dass sich bei einer Anoxie, beispielsweise während einer ischämischen Herzattacke,
der Protonengradient aufgrund der einsetzenden Glykolyse auflöst.
Dadurch würde das Enzym dann beginnen, rückwärts zu laufen.
Es würde das erzeugte ATP zerstören.
Aber dieses Protein wird durch einen Mechanismus aktiviert, den ich hier nicht beschreibe,
der normalerweise untätig ist und dann eingreift, um die Rückreaktion zu stoppen.
Und wenn man den Protonengradienten wiederherstellt, erneut die Bedingungen herstellt,
unter denen Sauerstoff vorhanden ist, erfolgt die Drehung in umgekehrter Richtung und wird der Inhibitor entfernt.
Und das ist aus Enzymperspektive eine bemerkenswerte Eigenschaft eines unidirektionalen Inhibitors.
Er verhindert nur die ATP-Hydrolyse und nicht die Synthese.
Gerade ist es uns gelungen, Strukturen aufzuklären, bei denen 3 Inhibitor-Proteine an den Komplex gebunden sind.
Wir hatten sehr große Überschüsse an Inhibitoren mit spezifischen Mutationen, die ich nicht beschreiben möchte.
Und was wir sehen konnten … wenn man sich also vorstellt, dass das Inhibitor-Protein in freier Lösung vollständig ungeordnet ist,
beginnt es, sich über die am weitesten geöffnete dieser drei katalytischen Schnittstellen,
über die sogenannte leere E-Schnittstelle an den ATPase-Komplex zu binden.
Und dann beginnt sich dieser kleine Kern einer Alpha-Helix zu bilden.
Der Rotor dreht um den 120-Grad-Schritt und wird dabei von der Hydrolyse des ersten ATP angetrieben.
Die Stelle schließt sich.
Und Sie erkennen, dass der Aspekt, auf den wir schauen, dass sich der Rotor verändert hat.
Und jetzt kann sich die Helix selbst ausdehnen und eine etwas längere Helix bilden.
Und dann erfolgt ein weiterer 120-Grad-Schritt, die Drehung des Rotors, der durch die Hydrolyse des zweiten ATP angetrieben wird.
Und jetzt kann der Inhibitor seine Struktur auf die Struktur erweitern, die wir in der Vergangenheit beobachtet hatten.
Das ist eine schöne Beobachtung, die für viele unerwartet war - dass man nämlich in der Lage sein würde,
sich faltende Zwischenprodukte von intrinsischen Inhibitor-Proteinen beobachten zu können.
Und das ist … dieses Papier wurde gestern von der PNAS angenommen.
Jetzt möchte ich Ihnen etwas über eine andere extrem wichtige Weise der Entkopplung der ATPase erzählen.
Und die erfolgt durch etwas, was als Permeabilitätstransitionspore bezeichnet wird (PTP).
Das Phänomen der Permeabilitätstransition ist seit über 30 Jahren bekannt.
Es gab aber keine molekulare Erklärung dafür.
Lassen Sie mich das erläutern.
Also links … links können Sie vergessen.
Das ist eine Darstellung der Apoptose, die, wie Sie wissen, zum Zelltod führt.
Rechts wird dargestellt, wie man sich die Auslösung einer Nekrose vorstellt, einer anderen Form des Zelltods.
Angenommen wird, dass als Reaktion auf verschiedenartige Belastungen Calcium freigesetzt wird.
Es könnte reaktiver Sauerstoff sein.
Es könnten viele Dinge sein.
In diesem Fall wird Sauerstoff … Calcium-Ionen aus dem endoplasmatischen Retikulum ins Cytoplasma freigesetzt.
Unter diesen Bedingungen werden die Calcium-Ionen von Proteinen in den Innenmembranen der Mitochondrien
in die Matrix der Mitochondrien aufgenommen.
Und dieser Einstrom von riesigen Calcium-Mengen hat den Effekt, eine Pore zu eröffnen,
die als mitochondriale Permeabilitätstransitionspore bezeichnet wird.
Und die wird durch ein Protein reguliert, das Kurt Wüthrich gestern erwähnt hat,
Cyclophilin D, an das Cyclosporin A bindet.
Cyclosporin A verhindert also tatsächlich die Öffnung dieses Kanals.
Und man geht davon aus, dass dieser Kanal, ein sehr großer Kanal, Moleküle von bis zu 1,5 kDa freisetzt.
Das schöpft den Inhalt der Mitochondrien-Matrix ab.
Wasser strömt ein.
Die Mitochondrien schwellen an und zerbersten.
Und das löst den Zelltod durch Nekrose aus.
Solche Phänomene sind gut untersucht und bekannt.
Und die Frage war: Was ist die mitochondriale Permeabilitätstransitionspore?
Diese Veröffentlichung ist vor zwei, drei Jahren in der Nature erschienen.
Dort wird beschrieben, dass die Permeabilitätstransitionspore aus dem Dimer eines Transportproteins besteht,
das als Adenin-Nukleotid-Transporter bezeichnet wird.
Seine Funktion besteht darin, das in der Matrix erzeugte ATP zu entfernen und es nach außen zu befördern,
um es dem Rest der Zelle zur Verfügung zu stellen und auf dem Rückweg ADP mitzubringen.
Nach diesem Modell setzt sich der Kanal aus zwei dieser Proteine und zwei anderen Proteinen in der Außenmembran zusammen,
die als spannungsabhängiger Anionenkanal bezeichnet werden.
Und das ist total falsch.
Denn die Permeabilitätstransitionspore befindet sich tatsächlich innerhalb der Membrandomäne des ATPase-Komplexes.
Was wir in den letzten 18 Monaten mithilfe von RNAi in humanen Zellen gemacht haben,
ist die Entfernung jedes der Proteine in der peripheren Verbindungsachse, jedes dieser Proteine, die C-Proteine,
und dann mit einem anderen Verfahren, auf das ich nicht eingehe, die A-Proteine und auch die Gamma-Proteine.
Wir haben die alle nacheinander entfernt und beobachtet, welchen Effekt das auf die Öffnung der Permeabilitätstransitionspore hat.
Die Entfernung dieses Proteins hatte keine Wirkung.
Dieses hatte keine Wirkung, dieses hatte keine Wirkung, dieses hatte keine Wirkung, keine Wirkung, keine Wirkung.
Wichtig aber waren e, f, g DAPIT 6.8 Proteolipid und B.
Das sind die so genannten überzähligen Proteine.
Jedes von ihnen scheint eine Transmembranhelix zu haben.
Wir wissen nicht wirklich, wie viele Kopien von jedem vorhanden sind.
Das versuchen wir derzeit festzustellen.
Wir wissen nicht, in welche Richtung sie orientiert sind.
Ist der N-Terminus nach innen oder nach außen gerichtet?
Auf jeden Fall wird, wenn eines von ihnen unterdrückt wird, dieser Permeabilitätsübergang entfernt.
Wir wissen aber immer noch nicht genau, was die Pore ausmacht,
weil man bei einer Unterdrückung von E auch G aus dem ATPase-Komplex verliert und umgekehrt.
Und ähnliche Verbindungen gibt es zwischen diesen beiden Proteinen.
Wir können also heute nicht genau sagen, was das ist.
Unsere Schlussfolgerungen lauten deshalb, dass diese Proteine beteiligt sind.
Und A und C sind nicht beteiligt.
Jetzt wollen wir die exakte Struktur dieser Pore bestimmen.
Wir wollen Inhibitoren finden, die enormes medizinisches Potenzial enthalten.
Und so haben meine Bemühungen um diesen Enzymkomplex
seit nunmehr 35 Jahren einige weitere Fragen für Sie als junge Nachwuchswissenschaftler hinterlassen.
Wählen Sie Ihr Thema gut.
Sie werden auf jeden Fall Durchhaltevermögen benötigen, wenn Sie ein Problem wie dieses lösen wollen.
Und natürlich braucht jeder auch etwas Glück.
Und dann werden Sie sich vielleicht irgendwann in Stockholm wiederfinden, wie wir 1997.
Das sind also Paul Boyer, Jens Skou und ich, die Nobelpreisträger für Chemie.
Und wenn Sie genau hinschauen, werden Sie hier an der linken Seite Steven Chu erkennen, der seinen Preis für Physik erhalten hat.
Vielen Dank.
Applaus
