Thank you very much for the introduction and I also would like to say that it’s always a great pleasure to be here.
We now change gears and we go more into chemistry and biology and primarily structural and mechanistic chemistry.
I start off by showing you the place where I work.
That’s the Max Planck Institute of Biophysics in Frankfurt, and we focus on membrane proteins,
membrane-bound proteins, which have a number of many different functions.
Today I will focus, however, on the enzymes which reduce oxygen in your body,
or in the body of bacteria or other microorganisms, and generate energy.
Let me start by asking you what was the biggest catastrophe ever on Earth.
Actually, it was the so-called Great Oxygenation Event, also called the oxygen catastrophe or oxygen crisis.
And it was the most significant extinction event in Earth’s history.
It was caused by the living organisms, primarily by the ancestors of the present-day cyanobacteria.
These are little small algae that invented photosynthesis,
the oxygenic photosynthesis, which causes the release of oxygen.
This was the big catastrophe.
You see here that the original atmosphere on the Earth was reducing.
Earth was created about 4.5 billion years ago and life probably started to be around 4 billion years ago.
Oxygenic photosynthesis started about 3 billion years ago but the oxygen produced didn’t do much harm
because there was lots reducing substances around.
So there was no free oxygen available.
Only after about 2.5 billion years ago we got a significant increase of the oxygen level in the atmosphere.
And this was the catastrophe because what we have now in the atmosphere is molecular oxygen.
That’s triplet oxygen, that’s what we breathe in and what we use.
But of the other oxygen species you see here 4 are highly damaging.
If you get energy transfer on to the triplet oxygen by some dyes, excited dyes you get singlet oxygen
which oxidises most organic compounds.
If you put one electron onto the dioxygen you get a superoxide radical which is highly oxidising.
The second electron plus 2 protons gives you the hydrogen peroxide which is also very oxidising.
You use it for sterilising.
If you put a third electron and a proton on it, you get 2 hydroxyl radicals.
Hydroxyl radicals are the most damaging oxidising substances around.
And at the end, after the 4th electron and adding a proton, you get 2 water molecules.
These reactive oxygen species caused this death, the killing of most organisms at that time.
And of course the organisms had to cope with the threat.
And of course some of them could try to survive in oxygen-free niches like mines and so on.
There are also ways to remove dangerous intermediates,
for instance, by superoxide dismutases and peroxide catalases.
And the best way, of course, is to remove molecular oxygen via reduction to water by oxygen reductases.
And this lists the known oxygen reductases in biology.
In so-called methanogenic archaea we have di-iron flavoprotein which does this job.
Not much is known about it, I will show you some structural data on it.
Plants and many microorganisms contain a cyanide insensitive alternative oxidase
which is attached to energy-converting membranes but doesn't span it.
And then we have the 2 major classes: the heme-copper containing terminal oxidases
and the cytochrome bd oxidases which oxidise quinols.
I show you here the structure of the di-iron flavoprotein from methanogenic archaea.
You see there a di-iron centre, and you see here 2 flavin molecules
which are used to supply electrons for the reduction of oxygen to water.
We can go back to a crystallography in detail: You see here the 2 iron atoms, you see the ligands.
You see here the bridging carboxylate group into protein
and you have some rough ideas where the oxygen could bind and be reduced.
This has to happen very fast in order to prevent the formation of these reactive oxygen species.
But, as I said, not much is known about that enzyme.
Let’s go to the membrane-integrated terminal oxidases.
This is, as I mentioned already, cytochromes bd.
We have the members of the heme-copper containing terminal oxidases
and what they do is they not only detoxify the oxygen by reducing it.
They use the enormous energy at least with respect to biology and chemistry
which is inherent in the oxygen reduction reaction for the generation of biological energy forms
via building up electric voltages across membranes and building up pH gradients across these membranes.
The prime example is here the mitochondrial respiratory chain - that’s what you have in your body.
And the mitochondrial respiratory chain here starts off with NADH - NADH is, I should say, fixed hydrogen.
If you would have hydrogen available it would diffuse away and would at the end disappear into space.
And we don’t like that. So hydrogen in biology is fixed to coenzyme.
This is called NADH.
And here it actually is oxidised.
The electron is transferred on to quinols.
And then the electron goes further on.
It goes on, on a so-called complex 3, which is this complex.
And in this complex you get proton pumping across the membrane.
And you also have proton pumping across the membrane in complex 1.
Finally here in the respiratory chain you have the complex 4, cytochrome c oxidase which oxidises cytochrome c.
Cytochrome c is reduced by complex 3, and this is the terminal oxidase here.
So these complexes here work by transferring protons across the membrane.
This is here the membrane which is electrically tied.
So you can build up these electric voltages.
The electric voltage and the pH created drives protons back through the ATP synthase.
This is a very small rotatory engine and this engine creates ATP,
which is the general energy currency of life, from ADP and inorganic phosphate.
This happens continuously in your body.
Your body produces about 70 kilograms of ATP every day.
So the heme-copper terminal oxidases of the superfamily use electrons from cytochrome c,
some from hydroquinols or other from HIPIPs which are iron sulphur proteins.
They all come from the external side of the membrane.
They use protons from the internal membrane side.
They pump additional protons across the membrane in order to increase the yield of energy.
The heme-copper terminal oxidases in general have this reaction.
You have, of course, the dioxygen molecule.
You have 4 protons from the inner side of the membrane
and you have 4 cytochrome molecules from the outer side of the membrane.
And you have the oxygen diffusing in the membrane.
Oxygen is enriched in the membrane, diffuses in the membrane. Here we have the active side.
You get the electrons from the outer side and you get the protons from the inner side.
In addition, this enzyme family has developed a mechanism to pump 2 to 4 additional protons across the membrane
to increase the electric voltage – also called membrane potential – and to increase the pH gradient.
We want to understand actually how this machinery works.
I would like to mention here that this enzyme actually is well-known since many, many years.
It was a Scottish spectroscopist who discovered it, originally in 1887.
But we still do not know how it works.
Otto Warburg in Germany, he took up again this project.
He got the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1931
for his discovery of the nature and mode of action of the respiratory enzyme.
So you could believe that everything is already known
but I have to say we do not know actually how the machinery works.
It is still a challenge and I hope that some of you intelligent students
can contribute to our further understanding of this machinery.
Otto Warburg also, I have to say, did other important things.
He proposed that cancer cells generate energy by glycolysis.
This is only the breakdown fermentation of sugars but not by cellular respiration.
This cellular respiration is by effect of close to 10 more efficient in energy conservation than glycolysis.
And glycolysis also produces protons.
It is now generally accepted that cancer cells actually live primarily by glycolysis and not by cellular respiration.
He presented this hypothesis in detail here in 1966, so 50 years ago.
Tomorrow would be the 50th anniversary of his announcement.
The heme-copper oxidases are quite widespread in all of the living organisms.
We have 3 families within the super family and this is the type-A family.
Here we have the animals, the mammals and close to it we have bacteria which have very closely related enzymes.
Here we have the type-B family and the type-C family.
Actually in the lab we started type-A and type-C families.
The 3 families are diverse with respect to electron donors, subunit compositions and the heme types.
The A-family has here the central subunit which contains the bi-nucleoside
which reduces where the oxygen is bound and reduced.
And it has 2 channels, pathways for the transfer of protons.
One leads directly to the active site – this way, which is here –
and the other one actually leads nearby but also to the active site.
It must somehow divert protons towards the active site and to the outer site for protons to be pumped.
The B-type oxidase have only one of these proton transfer channels, otherwise they are pretty similar.
The C-type oxidases are very different.
They do not contain this yellow subunit,
instead, it’s replaced by some cytochrome molecules which contain heme groups
and not a carbon centre here for the delivery of electrons back to the active site.
I also should mention there is a paradox, because they appear to have been present in the living world
already before the photosynthetic oxygen evolution was invented.
The question then is, what was the original function of these oxidases?
One speculation was that they were derived from nitric oxide reductases.
But you can discard this because the nitric oxide reductases are closely related to the type-C heme-copper oxidases
and probably appeared really late in evolution.
We use X-ray crystallography to try to understand, to get the structure and to get functional hints.
And still the bottleneck is getting crystals.
It has become much easier nowadays.
Actually, when I worked in the photosynthetic reaction centre we needed crystals of at least 0.5 mm in diameter.
Nowadays people do this with 10 micrometre crystals, X-ray crystallography at the synchrotron.
And what’s also quite astonishing, it took me 4 months to collect one data set.
Nowadays it is done in 8 seconds at the synchrotron.
So this tells you really how technology development has speeded up.
With this cytochrome c oxidase we got the crystal to publish the structure, first structure of this type in 1995.
Here you see the central unit in yellow which is the subunit one which contains here the heme groups
and the copper-B which is where the oxygen is bound and reduced.
If you look more into the atomic details then you see here 2 copper-A atoms.
The copper-A atoms receive the electrons from cytochrome c, from here.
And then the electrons hop down onto this heme A that’s known from spectroscopy.
Then the electron is transferred further to the heme A3 and nearby we have the copper-B
where the electronhere can equilibrate between the 2 metals.
And oxygen is bound here when the 2 metals are in their reduced form.
That is how the electron density looks like.
What came as a surprise was that nearby we have a crosslink of a tyrosine, a tyrosine molecule,
covalent cross-linked to a nearby histidine.
The histidine is ligand here of this copper-B molecule
which provides maybe some hint that radicals are involved in the reaction
because radicals, tyrosine radicals, can form such kind of cross links more or less spontaneously.
Functionwise the structure, a different representation we have here,
now showing you the transmembrane, the helixes transmembrane, the strength of the protein.
We have here the active site.
The K-pathway leading straight towards the active site
and here the D-pathway being in a more curved way and which transfer both protons.
On the other side we have cytochrome c binding, cytochrome c provides here the electron for the reaction.
We have 8 protons here involved in the whole business, we have 1 oxygen, we have 4 cytochrome c molecules.
So it’s 13 substrates but we have no idea about the precise order of these 13 substrates
at which they arrive at the bi-nuclear site and how they are used.
Proton transfer is supposed to occur according to the Grotthuss mechanism.
So we have a hydrogen-bonded chain like this.
You can add one proton at one end of the chain and then you shift the proton.
You then get electron release here.
You can then rotate along this bond back and you have release of a proton on that side.
You have to transfer it by this mechanism, the proton from here to there.
This may actually happen in the system because you see here a very nice water chain
with some amino acid residues contributing.
This is the D pathway where a water chain is here, leading up here to glutamate residue.
But actually it’s interrupted here by some asparagine residues, it’s blocked.
Probably this prevents some bad side reaction and we actually have to remove that block for the proton transfer.
Now what about proton pumping?
The most convincing principle so far is the charge compensating principle.
Basically it says that each electron transfer into the hydrophobic part of the enzyme is charge compensated
by the uptake of one proton from the opposite side of the membrane.
So you form some kind of ion pair within the protein which is supposed to be energetically more favourable
than having a single negative charge of the electron in the membrane face.
The protons taken up via the D-pathway in order to compensate the negative charge of the reducing electrons
are those which are being pumped.
Then you get another electron coming in directly to the active site and this electrostatically repels the protons
which have taken up first and which are consumed at the active site.
This is probably the mechanism accepted by most people but there are still some doubts on it.
One question which was quite long under debate was, actually,
what is in the active site between the heme iron and the copper-B?
In 2006 there was another structure published.
It was pretty clear that the peroxide already here fits well into the oxidised form
but it’s not expected in the oxidised enzyme.
We also had analysed our structure more carefully
and we also found that the best fit at our 2.2 Angstrom resolution structure into that bridge is a dioxygen molecule.
So we believe that peroxide-dianion is there but this actually was not accepted by the community.
For me peroxide in the active site is attractive
because it’s the best fit for the electron density in the structure-determined enzyme.
Bridging peroxide dianion would provide the best electrostatic compensation
for positive charges at the iron of the heme a3 and the copper-B .
It could be singly protonated upon the first reduction, and receive a second proton upon the second reduction.
It could leave the binuclear site and make it available for dioxygen binding.
This sequence would explain why a singly reduced active site does not bind dioxygen.
A few words about the catalytic cycle of cytochrome c oxidase.
When you isolate the enzyme normally you have it in the oxidised form.
Then you start to reduce the enzyme, normally by cytochrome c.
You take up a proton at the same time and you get one electron in reduced form.
Then you put in the second electron, a second proton, you get the reduced form.
And if 2 electrons are at the binuclear site you can bind oxygen.
It forms an adduct, similar as myoglobin or haemoglobin does, and then the reaction goes on.
That was the belief that actually this forms a peroxide by a transfer of one proton on to the oxygen.
But actually this was ruled out, and it’s clear that already in this state we have here an oxoferryl state.
We have a split oxygen bound here.
Put in the third electron and you get something called the oxoferryl state, fourth electron and you are back.
The problem with this catalytic cycle is that the purified oxidised form already contains a peroxide dianion
bridging the heme a3 iron and Copper-B.
And this is now known for sure because our Japanese colleagues used the radiation of the free-electron laser in Japan
where you have a 20 femtosecond X-ray pulse.
You hit the crystal position once and you get a diffraction pattern before radiation damage can occur.
They did it by shifting the crystal several thousand times
and got a complete data set and could later identify that there is a peroxide bridge between heme a3 iron and Copper-B.
And this will cause us to rethink the mechanism and role of cytochrome c oxidase.
I want to mention that the so-called P-state contains already an oxoferryl-iron.
The dioxygen bond is split.
This was done by resonance Raman spectroscopy mainly in Japan by Kitagawa
and later by the Babcock group in the United States.
If you think about the splitting of the dioxygen bond then you need 4 electrons for that.
The missing fourth electron is postulated to originate from that cross-link tyrosine residue
which I think is a convincing proposal but it’s clear that there is no peroxide-state during the cycle.
Now I change gears a little bit and tell you about cbb3 cytochrome c oxidases.
The C-family, they have been discovered rather recently, in the 1990s.
They are essential enzymes for nitrogen fixation in Rhizobia.
They remove the oxygen in order to maintain anaerobic conditions which are required for nitrogen fixation.
In the presence of oxygen the nitrogen fixation apparatus is destroyed.
They are also essential for the pathogenicity of some bacteria:
Helicobacter – causing stomach ulcers – and Campylobacter.
They only share the subunit 1 which is called fixN from fixation, nitrogen fixation with the A- and B-type terminal oxidases.
They use the firmly bound cytochrome c subunits for electron supply.
We have determined the structure of the Pseudomonas stutzeri enzyme.
That is now the structure: This is the subunit one.
You have the second subunit, a cytochrome c, a third subunit which contains here 2 heme groups.
When you compare the architecture of the central subunit it’s pretty similar with respect to the transmembrane part.
But it’s dissimilar when you look at the loops on both sides of the membrane.
With respect to electron transfer it’s most likely this heme gets an electron from a soluble cytochrome here.
Electron transfer occurs and then this down here.
Then final step here towards the active site with containing the heme b3 now and Copper.
In general we have shorter distances for the electron transfer than in the A-type oxidases
which means faster electron transfer and better oxygen trapping low Km value for the oxygen binding here.
So more efficient enzymes.
Looking into details you can see here we have the Copper-B, we have the heme a3 iron,
we have also a cross-linked tyrosine here but this is very different.
Then we have here some differences towards other residues.
We have glutamate residue here which was also quite unexpected.
We also have here a calcium ion bound which is ligated here to 3 of the heme propionates.
So it neutralises an arginine.
So we have 3 positive charges, 1 arginine, 2 calcium charge compensating the free negative charges
on the heme propionates here which appears to be important.
Another important difference to the A-family enzymes
is that the cross-linked tyrosine residue originates from a different transmembrane helix.
In the A-type it’s this green one, from this helix here,
and in the type-C family it originates from this one and they crosslink which you see in the same residue here.
So this was of course not expected, but the crosslink is very well established also by mass spectrometry.
A different view of the same you have here of the type-A families.
You have it from this helix, the tyrosine residue in the C-type family, you have the tyrosine residue over from this family.
We have a K-pathway equivalent which allows proton transfer towards an active site.
We also can clearly show that the D-pathway is absent.
We have blocks here.
The D-pathway, hydrophobic a big aromatic residue, tryptothane phenylalanines, tyrosine residue,
which clearly block proton transfer towards this site that we had in the A-family enzyme.
So conclusion here is that the cbb3 oxidases possess a completely different electron system.
The distances are shorter leading to the faster electron transfer.
We have only one proton transfer pathway.
Nevertheless the enzymes pump protons,
and that’s difficult to understand in the framework of that electrostatic repulsion hypothesis.
The 2 heme propionates are not available for proton pump loading because of calcium binding.
And I also say the NO reductases are structurally very similar to the cbb3 oxidases although they do not pump protons
and take the protons from outer face of the membranes.
So the NO reductases use 2 cytochrome c molecules, 2 NO molecules, 2 protons from the outside and 1 oxygen molecule.
They get oxidised cytochrome c, N2O and water by the NO reductases but structure is pretty similar.
Now I turn gears and come to the bd oxidases.
They are widespread among the prokaryotes.
They are essential for the pathogenicity of many human pathogens also.
In particular the mycobacteria which causes tuberculosis need a functional cytochrome bd oxidase.
They do not pump protons.
They generate electric voltages and pH gradients by releasing protons from quinols to one side of the membrane
and take up protons for water formation from the opposite side.
I would like to say bd oxidases differ also from the copper oxidases by their inhibitor sensitivity.
I haven’t heard so far anything about Schrödinger’s cat.
Schrödinger’s cat actually is killed by the cyanide which blocks the A-type cytochrome c oxidase.
But it wouldn’t work if the cat would have a bd oxidase because the bd oxidase is not blocked by cyanide.
And bd oxidase containing organisms probably survives in your gut
because you produce some stinking compound, mercaptoethanol, it’s sulphide, disulphide.
The sulphide in the gut actually blocks the heme-copper oxidase of many bacteria
and the bd oxidase containing organism in your gut have a survival advantage.
Ok, I have to say this was a 10 year venture together with Junshi Sakamoto from Japan.
But we could determine the structure finally and publish it just 2 months ago.
And the proposed model of the cytochrome b oxidase is shown here,
known from spectroscopy with a genesis of indirect experiments.
So you have here the quinol, the quinol here is oxidised.
Electrons are transferred to cytochrome B558, then to B595, and then to heme D
which is called bd oxidase which binds oxygen.
You get water formation.
Protons are taken up from the cytoplasm whereas the protons from the oxidation of the quinol are released here
which again leads to electric voltage across the membrane.
The reality is shown here.
To our big surprise we have the 2 big protein subunits
and the 2 big protein subunits have the identical structure, identical folding.
This reminds me of the photosynthetic reaction centre
where we had at the first membrane protein structure exactly the same finding.
The role of the 2 subunits was changed.
Here we have all the pigments are bound only to one subunit
and the other subunit is there with the identical protein fold but does not contain any pigments.
The binding site for the quinol is located here in this area where we have an extra loop which is not present on the other side.
In addition, we discovered another short protein subunit in the enzyme which was unknown before our work.
Now, the big surprise was that actually hemes hook up pretty well in the membrane, not at the outer surface.
And also the order of electron transfer must be just the opposite as believed.
So most likely the B558 gets first an electron but then it’s pretty clear that the heme D must get the electron.
Then the electron can equilibrate the heme B559.
These 2 are just inverted in the sequence as was expected from spectroscopy.
We also found an oxygen entry site towards the heme D molecule.
We also found proton transfer pathways.
To our surprise there appear to be 2 proton transfer pathways, one in the A-subunit and the other one in the D-subunit.
But, of course, their meaning, their importance-role still has to be worked out.
When I compare now the central prosthetic groups of the bd oxidases and the heme-copper oxidases we find some surprises.
For instance, for comparison we have here the first heme, heme A, and here the heme B558
which gets the electron from the quinol here, from the cytochrome, from the copper-A centre.
Then we have tryptophan residue in here.
We have a similar tryptophan residue in here.
And tryptophan residues actually can help you very much in the electron transfer,
actually, they also can be electron donors.
And then we have here the oxygen binding heme.
We have here the oxygen binding heme in the middle.
And here we have the other electron supplier which is here, copper-B.
And here it’s the heme B5595.
So the oxygen-binding heme posesses in both cases a central location.
This feature allows the rapid electron transfer from both sides on to the central heme irons and the oxygen molecule.
It appears to be that for the breaking of the oxygen bond
By that you do not get formation of super oxide, peroxide or hydroxyl radicals.
You have no damaging side reaction in this kind of enzymes.
So obviously the same mechanism was invented twice by Mother Nature to prevent the formation of this reactive oxygen species.
With that I am at the end, but I really do recognise there is still much to do.
I will tell you about the people who did most of the work.
That is the team which recently worked on the heme a3 type oxidases.
We got crystallography done by Juergen Koepke, spectroscopy by Iris von der Hocht.
The people doing the cbb3 oxidase are listed here.
Sabine Buschmann actually worked for 10 years trying to get the crystals - after 10 years she succeeded.
Structure was done by Ulrich Ermler. Julian Langer and Hao contributed biochemistry and mass spectrometry results.
And most recent the bd structure it was Schara Safarian, an outstanding student.
As you see he’s a weight lifter, he lifts heavy weights as was the structure of the bd oxidase.
And he got help from Julian Langer and with the mass spectrometry also from Julia Preu
and Hanne Mueller from the biochemical side.
With that I want to end and thank you for your attention.
Vielen Dank für die Einführung.
Ich möchte noch betonen, dass es immer eine große Freude ist, hier zu sein.
Wir wechseln das Thema - jetzt geht es um Chemie und Biologie, in erster Linie um strukturelle und mechanistische Chemie.
Zu Beginn zeige ich Ihnen, wo ich arbeite.
Das ist das Max-Planck-Institut für Biophysik in Frankfurt.
Wir befassen uns mit Membranproteinen - mit membrangebundenen Proteinen, die viele verschiedene Funktionen haben.
Mein heutiger Schwerpunkt liegt allerdings auf den Enzymen,
die den Sauerstoff in unserem Körper oder im Körper von Bakterien oder anderen Mikroorganismen reduzieren und Energie erzeugen.
Zu Beginn stelle ich Ihnen eine Frage: Was war die größte Katastrophe, die sich je auf der Erde ereignet hat?
Das war die so genannte große Sauerstoffkatastrophe, auch Sauerstoffkrise genannt.
Hierbei handelt es sich um das größte Aussterbeereignis der Erdgeschichte.
Verursacht wurde es von den lebenden Organismen, vor allem von den Vorfahren der heutigen Cyanobakterien.
Das sind kleine Algen, die die Photosynthese erfunden haben, die oxygene Photosynthese,
die die Freisetzung von Sauerstoff verursacht.
Das war die große Katastrophe.
Hier sehen Sie, dass die ursprüngliche Erdatmosphäre reduzierend war.
Die Erde entstand vor etwa 4,5 Milliarden Jahren.
Leben gibt es wahrscheinlich seit etwa 4 Milliarden Jahren.
Die oxygene Photosynthese begann vor etwa 3 Milliarden Jahren,
doch der dadurch produzierte Sauerstoff richtete nicht viel Schaden an, da es viele reduzierende Substanzen gab.
Es gab also keinen freien Sauerstoff.
Erst vor etwa 2,5 Milliarden Jahren stieg der Sauerstoffgehalt in der Atmosphäre signifikant an.
Und das war eine Katastrophe, denn jetzt befindet sich molekularer Sauerstoff in der Atmosphäre.
Das ist Triplett-Sauerstoff.
Es ist das, was wir einatmen und nutzen.
Doch 4 der anderen Sauerstoffarten, die Sie hier sehen, richten großen Schaden an.
Wenn ein Energietransfer zum Triplett-Sauerstoff durch Farbstoffe, durch angeregte Farbstoffe stattfindet,
erhält man Singulett-Sauerstoff, der die meisten organischen Verbindungen oxidiert.
Wenn man dem Sauerstoff, dem Disauerstoff, ein Elektron hinzufügt,
erhält man ein Superoxid-Radikal, das sehr stark oxidierend ist.
Das zweite Elektron plus 2 Protonen ergibt Wasserstoffperoxid, das ebenfalls sehr stark oxidierend ist.
Man verwendet es zum Sterilisieren.
Wen man ein drittes Elektron und ein Proton hinzufügt, erhält man 2 Hydroxylradikale.
Hydroxylradikale sind die schädlichsten oxidierenden Substanzen, die es gibt.
Und wenn man zum Schluss nach dem 4. Elektron noch ein Proton hinzufügt, erhält man 2 Wassermoleküle.
Diese reaktiven Sauerstoffarten verursachten den Tod der meisten zu jener Zeit lebenden Organismen.
Natürlich mussten die Organismen mit der Bedrohung umgehen.
Und natürlich konnten einige versuchen, in sauerstofffreien Nischen wie etwa Minen zu überleben.
Es gibt auch Möglichkeiten, gefährliche Zwischenprodukte zu entfernen, zum Beispiel durch Superoxiddismutase und Peroxidkatalase.
Am besten entfernt man molekularen Sauerstoff dadurch, dass man ihn durch Sauerstoffreduktase zu Wasser reduziert.
Hier sind die in der Biologie bekannten Sauerstoffreduktasen aufgeführt.
In sogenannten methanogenen Archaeen verrichten Di-Eisen-Flavoproteine diese Arbeit.
Darüber ist nicht viel bekannt.
Ich zeige Ihnen dazu ein paar strukturelle Daten.
Pflanzen und viele Mikroorganismen enthalten eine gegen Cyanid unempfindliche alternative Oxidase,
die an energieumwandelnden Membranen anhaftet, sie aber nicht überspannt.
Und dann gibt es 2 große Klassen:
die Häm-Kupfer enthaltende Terminaloxidase und die Cytochrom-bd-Oxidase, die Hydrochinon oxidiert.
Hier sehen Sie die Struktur des Di-Eisen-Flavoproteins von methanogenen Archaeen.
Wie Sie sehen, gibt es ein Di-Eisen-Zentrum, und hier sehen Sie 2 Flavinmoleküle,
die der Zuführung von Elektronen zur Reduktion von Sauerstoff zu Wasser dienen.
Mittels Röntgen-Kristallographie können wir ins Detail gehen: Hier sehen Sie die 2 Eisenatome.
Hier sehen Sie die Liganden.
Hier sehen Sie die überbrückende Carboxylatgruppe.
Jetzt haben Sie eine ungefähre Vorstellung davon, wo der Sauerstoff gebunden und reduziert werden könnte.
Um die Bildung dieser reaktiven Sauerstoffarten zu verhindern, muss das sehr schnell geschehen.
Aber wie ich schon sagte, über das Enzym ist nicht viel bekannt.
Wenden wir uns der membranintegrierten Terminaloxidase zu.
Das ist, wie erwähnt, Cytochrom-bd.
Es gibt die Angehörigen der Häm-Kupfer enthaltenden Terminaloxidasen,
die den Sauerstoff nicht nur entgiften, indem sie ihn reduzieren.
Sie verwenden die - jedenfalls für Biologie und Chemie - gewaltige Energie der Sauerstoff-Reduktionsreaktion
zur Bildung biologischer Energieformen durch die Erzeugung elektrischer Spannungen über Membrane hinweg
und zur Ausbildung von pH-Gradienten über diese Membrane.
Das Paradebeispiel hierfür ist die mitochondriale Atmungskette, die Sie in Ihrem Körper haben.
Die mitochondriale Atmungskette beginnt hier mit NADH.
NADH, das sollte ich erwähnen, ist fester Wasserstoff.
Wenn wir Wasserstoff zur Verfügung hätten, würde er ausdiffundieren und schließlich im Weltall verschwinden.
Das wollen wir nicht.
Deshalb ist Wasserstoff in der Biologie zu einem Coenzym verfestigt, das man NADH nennt.
Und hier ist es oxidiert.
Das Elektron wird auf Hydrochinon übertragen.
Und dann wandert das Elektron weiter.
Es wandert weiter auf einem sogenannten Komplex III, das ist dieser Komplex.
Und in diesem Komplex werden Protonen über die Membran gepumpt.
Auch im Komplex I werden Protonen über die Membran gepumpt.
Schließlich gibt es hier in der Atmungskette den Komplex IV, die Cytochrom-c-Oxidase, die Cytochrom-c oxidiert.
Cytochrom wird durch Komplex III reduziert.
Und das ist die Terminaloxidase.
Diese Komplexe arbeiten mit der Übertragung von Protonen über die Membran.
Das hier ist die Membran.
Sie ist elektrisch gebunden, weshalb man diese elektrischen Spannungen erzeugen kann.
Die elektrische Spannung und der pH-Gradient schicken die Protonen durch die ATP-Synthase zurück.
Das ist ein sehr kleiner Rotationsmotor.
Dieser Motor erzeugt ATP, die grundlegende Energiewährung des Lebens, aus ADP und anorganischem Phosphat.
Das geschieht ständig in Ihrem Körper.
Ihr Körper produziert täglich etwa 70 Kilogramm ATP.
Die Häm-Kupfer-Terminaloxidasen der Überfamilie nutzen Elektronen von Cytochrom-c,
einige von Hydrochinon und andere von HIPIPs - das sind Eisen-Schwefel-Proteine.
Sie kommen alle von der Außenseite der Membran.
Sie verwenden Protonen von der Membran-Innenseite.
Sie pumpen weitere Protonen über die Membran, um die Energieausbeute zu steigern.
Die Häm-Kupfer-Terminaloxidasen zeigen grundsätzlich diese Reaktion: Es gibt natürlich das Disauerstoff-Molekül.
Dann gibt es den in der Membran diffundierenden Sauerstoff.
Der Sauerstoff wird in der Membran angereichert, diffundiert in der Membran.
Hier ist die aktive Stelle.
Man erhält die Elektronen von der Außenseite und die Protonen von der Innenseite.
Diese Enzymfamilie hat außerdem einen Mechanismus entwickelt, durch den sie 2 bis 4 weitere Protonen über die Membran pumpt,
um die elektrische Spannung - auch Membranpotential genannt - und den pH-Gradienten zu erhöhen.
Wir wollen verstehen, wie dieser Mechanismus funktioniert.
An dieser Stelle ist zu erwähnen, dass dieses Enzym seit vielen, vielen Jahren bekannt ist.
Ein schottischer Spektroskopiker hat es im Jahr 1887 entdeckt.
Wir wissen aber immer noch nicht, wie es funktioniert.
Otto Warburg hat das Projekt in Deutschland wiederaufgenommen.
für seine Entdeckung des Wesens und der Wirkungsweise des Atmungsenzyms.
Man könnte glauben, dass schon alles bekannt ist, aber ich muss gestehen,
dass wir nicht wissen, wie dieser Mechanismus funktioniert.
Es ist immer noch eine Herausforderung, und ich hoffe, dass einige der hier versammelten gescheiten Studenten
zu unserem weiteren Verständnis dieses Mechanismus beitragen können.
Nachzutragen ist, dass Otto Warburg noch andere wichtige Leistungen vollbracht hat.
Er stellte die Theorie auf,
dass Krebszellen Energie durch Glykolyse erzeugen - das ist nur die Vergärung von Zucker -, aber nicht durch Zellatmung.
Die Zellatmung ist bei der Energieerhaltung annähernd 10-mal so effizient wie die Glykolyse.
Und die Glykolyse produziert auch Protonen.
Heute ist allgemein anerkannt, dass Krebszellen in erster Linie von Glykolyse leben, nicht von Zellatmung.
Er präsentierte diese Theorie hier im Jahr 1966, also vor 50 Jahren.
Morgen ist der 50. Jahrestag seines Vortrags.
Die Häm-Kupfer-Oxidasen sind in einem lebenden Organismus ziemlich weit verbreitet.
Die Überfamilie hat 3 Familien; das ist die Typ-A-Familie.
Hier haben wir die Tiere, die Säugetiere, und gleich daneben die Bakterien, deren Enzyme sehr nah verwandt sind.
Hier haben wir die Typ-B-Familie und die Typ-C-Familie.
Im Labor haben wir mit den Familien der Typen A und C begonnen.
Die 3 Familien unterscheiden sich im Hinblick auf Elektronendonatoren, die Zusammensetzung der Untereinheit und die Häm-Arten.
Die A-Familie hat hier die zentrale Untereinheit mit der binuklearen Stelle, wo der Sauerstoff gebunden und reduziert wird,
und sie hat 2 Kanäle - Pfade - für die Übertragung von Protonen.
Einer führt hier entlang direkt zur aktiven Stelle, die sich hier befindet.
Und der andere verläuft daneben, ebenfalls zur aktiven Stelle.
Er leitet irgendwie Protonen zur aktiven Stelle und zur Außenseite um, damit Protonen gepumpt werden.
Die Typ-B-Oxidase hat nur einen dieser Protonen-Übertragungskanäle.
Ansonsten sind sie sich ziemlich ähnlich.
Die Typ-C-Oxidasen sind ganz anders.
Sie enthalten nicht diese gelbe Untereinheit.
Stattdessen gibt es einige Cytochrom-Moleküle, die Häm-Gruppen enthalten,
und hier ist kein Kohlenstoffzentrum zur Rückführung von Elektronen zur aktiven Stelle.
Ich sollte erwähnen, dass es hier ein Paradox gibt, denn sie scheinen bereits in der belebten Welt aufgetaucht zu sein,
bevor die photosynthetische Sauerstoffentwicklung erfunden wurde.
Die Frage lautet also: Was war die ursprüngliche Funktion dieser Oxidasen?
Nach einer Theorie entstammten sie den Stickstoffmonoxid-Reduktasen.
Diese Theorie kann man aber verwerfen, da die Stickstoffmonoxid-Reduktasen mit den Typ-C-Häm-Kupfer-Oxidasen eng verwandt sind
und wahrscheinlich erst sehr spät in der Evolution auftauchten.
Wir versuchen, mithilfe von Röntgenkristallographie mehr zu verstehen,
um die Struktur zu erkennen und Hinweise auf die Funktion zu erhalten.
Und immer noch liegt die Schwierigkeit darin, Kristalle zu erhalten.
Es ist heute schon viel einfacher geworden.
Als ich am photosynthetischen Reaktionszentrum arbeitete, benötigten wir Kristalle mit einem Durchmesser von mindestens 0,5 mm.
Heutzutage verwendet man dafür Kristalle von 10 Mikrometern – mit Röntgenkristallographie am Synchrotron.
Was ebenfalls sehr verblüffend ist: Ich brauchte 4 Monate zur Erhebung eines Datensatzes.
Heutzutage wird das am Synchrotron in 8 Sekunden erledigt.
Daran können Sie erkennen, wie sich die technische Entwicklung beschleunigt hat.
Mit dieser Cytochrom-c-Oxidase erhielten wir das Kristall,
anhand dessen wir 1995 die Struktur, die erste Struktur dieses Typs veröffentlichen konnten.
Hier sehen Sie in gelb die Zentraleinheit, die Untereinheit 1,
die hier die Häm-Gruppen und das Kupfer-B enthält, wo der Sauerstoff gebunden und reduziert wird.
Sieht man sich die atomaren Details genauer an, erkennt man hier 2 Kupfer-A-Atome.
Die Kupfer-A-Atome erhalten die Elektronen vom Cytochrom-c, von hier.
Die Elektronen springen hinunter auf dieses Häm-A, das weiß man von der Spektroskopie,
dann werden die Elektronen weiter auf das Häm-A3 übertragen.
Und daneben haben wir das Kupfer-B, wo das Elektron hier zwischen den 2 Metallen äquilibrieren kann.
Der Sauerstoff wird hier gebunden, wenn die 2 Metalle reduziert sind.
So sieht die Elektronendichte aus.
Überraschend war, dass sich daneben die Querverbindung eines Tyrosin-Moleküls befand, kovalent mit dem Histidin daneben verbunden.
Das Histidin ist ein Ligand dieses Kupfer-B-Moleküls, was vielleicht einen Hinweis darauf gibt, dass Radikale an der Reaktion
beteiligt sind, denn Radikale, Tyrosin-Radikale, können Querverbindungen dieser Art mehr oder weniger spontan bilden.
Die Funktion der Struktur - eine andere Darstellung,
jetzt mit Balken, die Ihnen die Transmembran zeigen, die Helix-Transmembran, Proteinstränge.
Hier ist die aktive Stelle; der K-Pfad, der direkt zur aktiven Stelle führt und hier der D-Pfad, der hier etwas kurviger ist.
Beide übertragen Protonen.
Auf der anderen Seite haben wir die Cytochrom-c-Bindung; Cytochrom-c liefert hier das Elektron für die Reaktion.
An dem ganzen Prozess sind 8 Protonen beteiligt, 1 Sauerstoff- und 4 Cytochrom-c-Moleküle - das sind 13 Substanzen.
Aber wir haben keine Ahnung, in welcher genauen Reihenfolge diese 13 Substanzen an der binuklearen Stelle eintreffen
und wie sie eingesetzt werden.
Der Protonentransfer sollte nach dem Grotthuß-Mechanismus ablaufen.
Wir haben also eine wasserstoffgebundene Kette wie diese.
An einem Ende der Kette kann man ein Proton hinzufügen.
Dann verlagert man das Proton, woraufhin das Elektron hier abgegeben wird.
Dann kann man entlang dieser Bindung zurückrotieren, und an dieser Stelle wird ein Proton abgegeben.
Man muss das Proton durch diesen Mechanismus übertragen, von hier nach dort.
Das kann in dem System tatsächlich geschehen,
denn hier sehen Sie eine sehr schöne Wasserkette mit einigen beteiligten Aminosäureresten.
Das ist der D-Pfad; hier ist eine Wasserkette, die hier nach oben zu Glutamatresten führt.
Doch hier wird sie von einigen Asparaginresten unterbrochen; sie ist gesperrt.
Das verhindert wahrscheinlich ein paar schlimme Nebenreaktionen, und wir müssen diese Sperre für den Protonentransfer entfernen.
Was hat es mit dem Pumpen von Protonen auf sich?
Das bisher überzeugendste Prinzip ist das Prinzip der Ladungskompensation.
Es sagt im Wesentlichen aus, dass jeder Elektronentransfer in den hydrophoben Teil des Enzyms
durch die Aufnahme eines Protons von der gegenüberliegenden Seite der Membran ladungskompensiert wird.
Damit bildet man im Protein eine Art Ionenpaar, das energetisch günstiger sein soll,
als wenn es eine einzelne negative Ladung des Elektrons an der Vorderseite der Membran gäbe.
Die Protonen, die über den D-Pfad zur Kompensation der negativen Ladung der reduzierenden Elektronen aufgenommen werden,
sind jene, die gepumpt werden.
Dann kommt ein anderes Elektron herein, direkt zur aktiven Stelle, und dieses Elektron stößt die Protonen,
die zuerst aufgenommen wurden und an der aktiven Stelle verbraucht werden, elektrostatisch ab.
Das ist wohl der von den meisten akzeptierte Mechanismus, aber es gibt noch ein paar Zweifel.
Eine Frage war ziemlich lang umstritten: Was befindet sich an der aktiven Stelle zwischen dem Häm-Eisen und dem Kupfer-B?
Im Jahr 2006 wurde dann eine weitere Struktur veröffentlicht.
Es war recht klar, dass das schon hier befindliche Peroxid gut zu der oxidierten Form passt,
aber im oxidierten Enzym wird es nicht erwartet.
Eine noch sorgfältigere Analyse unserer Struktur ergab,
dass in unserer mit 2,2 Angström aufgelösten Struktur ein Disauerstoff am besten in diese Brücke passte.
Wir glauben also, dass es dort ein Peroxid-Dianion gibt, aber das wurde von der wissenschaftlichen Gemeinschaft nicht akzeptiert.
Für mich ist Peroxid in der aktiven Stelle attraktiv,
denn es passt am besten zur Elektronendichte in dem durch die Struktur vorgegebenen Enzym.
Ein überbrückendes Peroxid-Dianion würde die beste elektrostatische Kompensation für positive Ladungen
am Eisen des Häm-a3 und des Kupfer-B bieten.
Es könnte mit der ersten Reduktion einzeln protoniert werden und mit der zweiten Reduktion ein zweites Proton empfangen.
Es könnte die binukleare Stelle verlassen und sie für die Disauerstoff-Bindung zur Verfügung stellen.
Diese Sequenz würde erklären, warum eine einzeln reduzierte aktive Stelle keinen Disauerstoff bindet.
Ein paar Worte zum katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase:
Wenn man das Enzym isoliert, liegt es normalerweise in oxidierter Form vor.
Dann beginnt man damit, das Enzym zu reduzieren, normalerweise durch Cytochrom-c.
Man nimmt gleichzeitig ein Proton auf und erhält ein Elektron in reduzierter Form.
Dann fügt man das zweite Elektron hinzu, das zweite Proton, und man erhält die reduzierte Form.
Und wenn sich an der binuklearen Stelle 2 Elektronen befinden, kann man Sauerstoff binden.
Sie bildet ein Addukt, so ähnlich wie Myoglobin oder Hämoglobin, und dann setzt sich die Reaktion fort.
Die Ansicht ging dahin, dass dies durch den Transfer eines Protons zum Sauerstoff ein Peroxid bildet.
Das wurde aber verworfen.
Und es ist klar, dass wir schon hier einen Oxoferryl-Zustand haben.
Wir haben einen gespaltenen Sauerstoff, der hier gebunden ist.
Wenn das dritte Elektron hinzugefügt wird, erhält man den sogenannten Oxoferryl-Zustand, das vierte Elektron, und man ist zurück.
Das Problem mit diesem katalytischen Zyklus liegt darin, dass die gereinigte, oxidierte Form bereits ein Peroxid-Dianion enthält,
welches das Häm-a3-Eisen und das Kupfer-B überbückt.
Das weiß man heute mit Sicherheit, da unsere japanischen Kollegen die Strahlung des Freie-Elektronen-Lasers nutzten,
mit einem Röntgenpuls von 20 Femtosekunden.
Man trifft die Kristallposition einmal und erhält ein Beugungsmuster, bevor Strahlungsschäden auftreten können.
Hierzu verlagerten sie den Kristall mehrere tausend Male.
Sie erhielten einen vollständigen Datensatz und konnten später feststellen,
dass zwischen dem Häm-a3-Eisen und dem Kupfer-B eine Peroxidbrücke ist.
Das wird uns dazu veranlassen, den Mechanismus und die Funktion der Cytochrom-c-Oxidase zu überdenken.
Ich möchte erwähnen, dass der sogenannte P-Zustand bereits 1 Oxoferryl-Eisen enthält.
Die Disauerstoffbindung ist gespalten.
Das wurde durch Resonanz-Raman-Spektroskopie festgestellt,
hauptsächlich in Japan durch Kitagawa und später von der Babcock-Gruppe in den Vereinigten Staaten.
Wenn man die Disauerstoffbindung spalten möchte, benötigt man hierzu 4 Elektronen.
Es wird postuliert, dass das fehlende vierte Elektron von diesem verbundenen Tyrosinrest stammt.
Ich halte das für einen überzeugenden Vorschlag, aber es ist klar, dass es während des Zyklus keinen Peroxidzustand gibt.
Jetzt wechsle ich das Thema und erzähle Ihnen etwas über die cbb3-Cytochrom-c-Oxidase.
Die C-Familie wurde vor noch gar nicht so langer Zeit entdeckt, in den Neunzigern.
Es handelt sich um wichtige Enzyme zur Stickstofffixierung in Rhizobien.
Sie entfernen den Sauerstoff, um die anaeroben Bedingungen,
die für die Stickstofffixierung erforderlich sind, aufrecht zu erhalten.
In Gegenwart von Sauerstoff wird der Stickstofffixierungsapparat zerstört.
Sie sind außerdem wichtig für die Pathogenität einiger Bakterien
wie Helicobacter - die Magengeschwüre hervorrufen - und Campylobacter.
Mit den Terminaloxidasen der Typen A und B haben sie nur die Untereinheit 1 gemeinsam,
genannt FixN - nach „nitrogen fixation“ (Stickstofffixierung).
Zur Elektronenzufuhr verwenden sie die stark gebundenen Cytochrom-c-Untereinheiten.
Wir haben die Struktur des Pseudomonas stutzeri-Enzyms bestimmt.
Hier sehen Sie die Struktur: Das ist die Untereinheit 1.
Hier ist die zweite Untereinheit, ein Cytochrom-c, eine dritte Untereinheit, die hier 2 Häm-Gruppen enthält.
Im Vergleich dazu ist die Architektur der zentralen Untereinheit ziemlich ähnlich, was den transmembranen Teil betrifft.
Aber wenn man die Schleifen auf beiden Seiten der Membran betrachtet, zeigen sich Unterschiede.
Was den Elektronentransfer betrifft, ist es am wahrscheinlichsten,
dass dieses Häm hier ein Elektron von einem löslichen Cytochrom erhält.
Nach dem Elektronentransfer geht es hier hinunter,
und dann den letzten Schritt zur aktiven Seite, die jetzt das Häm-b3 und Kupfer enthält.
Im Allgemeinen sind die Entfernungen für den Elektronentransfer kürzer als bei den Typ-A-Oxidasen,
was einen schnelleren Elektronentransfer, einen besseren Sauerstoffeinfang
und einen niedrigeren KM-Wert für die Sauerstoffbindung hier zur Folge hat.
Die Enzyme sind also effizienter.
Wenn man sich das genauer ansieht, kann man hier das Kupfer-B erkennen, das Häm-a3-Eisen.
Hier ist auch ein verbundenes Tyrosin, aber das ist ganz anders.
Es gibt ein paar Unterschiede zu anderen Resten.
Hier sind Glutamatreste, womit man gar nicht gerechnet hatte.
Hier haben wir außerdem eine Kalzium-Ionen-Bindung, die hier an 3 der Hämpropionate gebunden ist.
Sie neutralisiert 1 Arginin.
Wir haben also 3 positive Ladungen, 1 Arginin, zweimal Kalzium,
welche die 3 negativen Ladungen an den Hämpropionaten hier kompensieren.
Das scheint wichtig zu sein.
Ein weiterer wichtiger Unterschied zu den Enzymen der A-Familie besteht darin,
dass der verbundene Tyrosinrest von einer anderen Transmembranhelix stammt.
Bei Typ A ist es der grüne, von dieser Helix, und in der Typ-C-Familie stammt er von dieser Helix.
Wie Sie sehen, verbinden sie sich hier im selben Rest.
Damit hatte man natürlich nicht gerechnet, doch die Verbindung ist auch durch Massenspektrometrie sehr gut bestätigt.
Hier sehen Sie dasselbe in einer anderen Ansicht.
Bei den Typ-A-Familien kommt der Tyrosinrest von dieser Helix,
und bei der Typ-C-Familie stammt der Tyrosinrest von dieser Familie.
Es gibt ein K-Pfad-Äquivalent, das den Protonentransfer zu einer aktiven Stelle ermöglicht.
Wir können außerdem eindeutig zeigen, dass der D-Pfad fehlt.
Hier sind Sperren.
Der D-Pfad, hydrophob, ein großer aromatischer Rest, Tryptophan, Phenylalanine, Tyrosin,
die den Protonentransfer zu dieser Stelle, den wir im Enzym der A-Familie hatten, blockieren.
Daraus lässt sich der Schluss ziehen, dass die cbb3-Oxidasen ein vollständig anderes Elektronensystem besitzen.
Die Entfernungen sind hier kürzer, was dazu führt, dass der Elektronentransfer schneller ist.
Wir haben nur einen Pfad für den Protonentransfer.
Dessen ungeachtet pumpen die Enzyme Protonen, was im Rahmen der Hypothese der elektrostatischen Abstoßung schwer zu verstehen ist.
Die 2 Hämpropionate stehen wegen der Kalziumbindung nicht zum Laden der Protonenpumpe zur Verfügung.
Ich sage außerdem, dass die NO-Reduktasen den cbb3-Oxidasen strukturell sehr ähnlich sind,
obwohl sie keine Protonen pumpen und die Protonen von der Außenseite der Membran aufnehmen.
Die NO-Reduktasen verwenden also 2 Cytochrom-c-Moleküle, 2 NO-Moleküle, 2 Protonen von der Außenseite und 1 Sauerstoffmolekül.
Sie erhalten durch die NO-Reduktasen oxidiertes Cytochrom c, N2O und Wasser, doch die Struktur ist ganz ähnlich.
Jetzt wechsle ich das Thema und komme zu den bd-Oxidasen.
Sie sind unter den Prokaryoten weit verbreitet.
Auch für die Pathogenität vieler Humanpathogene sind sie von großer Bedeutung.
Vor allem die Mykobakterien, die Tuberkulose hervorrufen, benötigen eine funktionelle Cytochrom-bd-Oxidase.
Sie pumpen keine Protonen.
Sie erzeugen elektrische Spannungen und pH-Gradienten, indem sie Protonen von Hydrochinonen an eine Seite der Membran freisetzen
und von der gegenüberliegenden Seite Protonen zur Bildung von Wasser aufnehmen.
Ich möchte erwähnen, dass sich bd-Oxidasen durch ihre Inhibitor-Sensitivität auch von den Kupfer-Oxidasen unterscheiden.
Bis jetzt habe ich noch nichts von Schrödingers Katze gehört.
Schrödingers Katze wird ja durch das Zyanid getötet, das die Typ-A-Cytochrom-c-Oxidase blockiert.
Das würde aber nicht funktionieren, wenn die Katze eine bd-Oxidase hätte, da die bd-Oxidase durch das Zyanid nicht blockiert wird.
Und Organismen, die bd-Oxidasen enthalten, können in Ihrem Darm überleben,
da Sie eine stinkende Verbindung produzieren - Mercaptoethanol; das ist Schwefel, Disulfid.
Der Schwefel im Darm blockiert die Häm-Kupfer-Oxidase vieler Bakterien,
und die Organismen in Ihrem Darm, die bd-Oxidasen enthalten, haben einen Überlebensvorteil.
Das war ein zehnjähriges Projekt, zusammen mit Junshi Sakamoto aus Japan.
Aber schließlich konnten wir die Struktur bestimmen und vor 2 Monaten veröffentlichen.
Das vorgeschlagene Modell der Cytochrom-B-Oxidase sehen Sie hier,
bekannt aus der Spektroskopie, entstanden aus indirekten Experimenten.
Hier sehen Sie das Hydrochinon; das Hydrochinon hier ist oxidiert.
Elektronen werden übertragen - zu Cytochrome B558, dann zu B595 und dann zum Häm.
Das nennt man bd-Oxidase, die Sauerstoff bindet.
Es bildet sich Wasser.
Vom Zytoplasma werden Protonen aufgenommen, während die Protonen des Hydrochinons hier freigesetzt werden,
was wiederum zu elektrischer Spannung über die Membran führt.
Hier sehen Sie, wie es in der Realität aussieht.
Zu unserer großen Überraschung gibt es 2 große Protein-Untereinheiten,
und diese 2 großen Protein-Untereinheiten weisen identische Strukturen, eine identische Faltung auf.
Das erinnert mich an das photosynthetische Reaktionszentrum,
wo wir bei der ersten Membranproteinstruktur genau die gleiche Feststellung machten.
Die Funktion der 2 Untereinheiten ist anders.
Hier sind alle Pigmente nur an eine Untereinheit gebunden.
Die andere Untereinheit weist die identische Proteinfaltung auf, enthält aber keine Pigmente.
Die Bindungsstelle für das Hydrochinon befindet sich hier in diesem Bereich,
wo eine zusätzliche Schleife ist, die an der anderen Seite fehlt.
Darüber hinaus entdeckten wir eine weitere, kurze Protein-Untereinheit in dem Enzym, das vor unserer Arbeit unbekannt war.
Die großen Überraschungen bestanden darin, dass sich das Häm in der Membran ziemlich gut verhakt, nicht an der Außenseite.
Außerdem muss der Elektronentransfer genau andersherum ablaufen als geglaubt.
Höchstwahrscheinlich erhält also das B558 zuerst ein Elektron,
aber es ist auch ziemlich klar, dass das Häm-D das Elektron erhalten muss.
Dann kann das Elektron das Häm-B559 äquilibrieren.
Die Reihenfolge dieser beiden ist also in der Sequenz anders, als man von der Spektroskopie erwartete hatte.
Wir fanden außerdem eine Sauerstoffeintrittsstelle in das Häm-D-Molekül.
Darüber hinaus fanden wir Protonentransferpfade.
Zu unserer Überraschung scheint es 2 Protonentransferpfade zu geben –
einen in der Untereinheit A und den anderen in der Untereinheit D.
Aber ihre Bedeutung, die Bedeutung ihrer Funktion muss man natürlich erst noch herausfinden.
Wenn wir jetzt die zentralen prosthetischen Gruppen der bd-Oxidase mit denen der Häm-Kupfer-Oxidase vergleichen,
stoßen wir auf einige Überraschungen.
Beispielsweise haben wir zum Vergleich das erste Häm, Häm-A, und hier das Häm-B558,
welches hier das Elektron vom Hydrochinon erhält, vom Cytochrom, vom Kupfer-A-Zentrum.
Dann gibt es hier einen Tryptophanrest.
Einen ähnlichen Tryptophanrest finden wir hier drin.
Tryptophanreste können beim Elektronentransfer sehr hilfreich sein, sie können sogar Elektronendonatoren sein.
Und dann haben wir hier das sauerstoffbindende Häm.
Hier in der Mitte befindet sich das sauerstoffbindende Häm.
Hier ist der andere Elektronenlieferant, Kupfer-B.
Und hier ist das Häm-B5595.
Das sauerstoffbindende Häm nimmt also in beiden Fällen einen zentralen Standort ein.
Diese Eigenschaft ermöglicht einen schnellen Elektronentransfer von beiden Seiten
zu den zentralen Häm-Eisen und zum Sauerstoffmolekül.
Wie es scheint, werden für das Aufbrechen der Sauerstoffbindung
Die Bildung von Superoxid, Peroxid oder Hydroxylradikalen wird hierdurch vermieden.
In dieser Art von Enzymen gibt es keine schädigenden Nebenreaktionen.
Offenbar hat Mutter Natur denselben Mechanismus zur Verhinderung der Bildung dieser reaktiven Sauerstoffarten zweimal erfunden.
Damit bin ich am Ende angelangt.
Aber mir ist klar, dass immer noch viel zu tun bleibt.
Ich möchte Ihnen jetzt etwas über jene Menschen erzählen, die den größten Teil der Arbeit geleistet haben.
Hier sehen Sie das Team, das noch vor kurzem an der Typ-Häm-3-Oxidase gearbeitet hat.
Die Kristallographie erledigte Jürgen Köpke, Iris von der Hocht die Spektroskopie.
Die Personen, die an der cbb3-Oxidase gearbeitet haben, sind hier aufgeführt.
Sabine Buschmann versuchte 10 Jahre lang, die Kristalle zu erhalten.
Nach 10 Jahren hatte sie Erfolg.
Für die Struktur waren Ulrich Ermler und Julian Langer zuständig.
Hao steuerte die Ergebnisse der Biochemie und der Massenspektrometrie bei.
Der letzte Neuzugang zur bd-Struktur war Schara Safarian, ein herausragender Student.
Wie Sie sehen, ist er Gewichtheber - er hebt schwere Gewichte wie etwa die Struktur der bd-Oxidase.
Unterstützt wurde er von Julian Langer mit der Massenspektrometrie,
außerdem von Julia Preu und Hanne Müller von Seiten der Biochemie.
Zum Schluss möchte ich mich für Ihre Aufmerksamkeit bedanken.
