Craig Mello

RNAi and development in C. elegans

Category: Lectures

Date: 2 July 2007

Duration: 65 min

Quality: SD

Subtitles: EN DE

Craig Mello (2007) - RNAi and development in C. elegans

Argonaute proteins interact with small RNAs to mediate gene silencing. C. elegans contains 27 Argonaute homologs, raising the question of what roles these genes play in RNAi and related gene-silencing pathways. Through our collaborator, Dr

I think we should try to start, it is nine o’clock and I wish you all welcome to the start of the lectures for this year. The first session has already an alteration because Sir John who was supposed to be the third speaker could not come. For that reason we have made the following decision. The three remaining lectures will each one be extended by about five minutes. In addition after the first lecture we will try an experiment and do questions from the audience. And with these questions and the elongations of each of the talks we will be back in normal time again. We don’t have questions after all talks but since the first talk is by the freshest Nobel laureate, from last year, we decided that we do it after the first talk. And then also the coffee break will be after the first talk and this question round. So we will have coffee between 10.05 and 10.40. And we therefore restart ten minutes early to allow for the extension also to the second and third speaker. With these words we are then ready to start. The first speaker is Professor Craig Mello from the University of Massachusetts, the Medical School in Worcester, USA. And he got the award, as I just said, last year. He got it “for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA”. Please, Professor Mello. Thank you. Thank you, thank you Hans. So it’s a pleasure and a real great honor to be here. I look forward to having an opportunity to have many conversations and discussions with everyone here during the course of the next few days. So let me go ahead and I’ll get started. I’ve sort of retitled my talk. RNAi, rethinking gene regulation, evolution and medicine, or how a worm won five Nobel Prizes in medicine. I’m going to go ahead and start my talk with a sort of an unusual first slide here. I don’t know if you—can we have the lights down a little bit. This is Dick Cheney and I at the White House. When you win a prize like this one of the special benefits is you get to go meet leaders of your country or people around the world who have important roles in politics. Can I have the lights down on the stage. I think it’s too light. Can you see that alright. You can see I’m not standing too close to him. His approval rating right now in the US is about 7%, he’s the Vice President, but a lot of people think he’s the smart one. But the important thing and one of the reasons I show this is, it’s very important to vote and get involved in politics, you know, no matter whether you voted for him or not. Now if you can’t vote in your country and some of you probably can’t, it’s certainly important to educate everyone that you talk to, educate people about what’s going on in the world, talk to people, it’s very important. And one of the issues that I think is important for us to discuss here is whether it might be wise in the future to always have the Lindau meetings be interdisciplinary. Because I think one of the things that’s happening to science is, it is already very interdisciplinary. Biomedicine for example is very dependent on physics and chemistry, I think. But also political issues are very important. So I think it’s important to have a very interdisciplinary focus at the university as well as in settings like this to try to get that dialogue going. I went to Washington DC, hoping to be able to tell the Bush administration how important RNA interference is as a technology and how well it fits with the genome sequencing project, which together are really changing, along with other great technologies, the way that we do and practice medicine. And opening many opportunities for new types of medicine, linking human disease with genetics. Unfortunately all we did was have a very brief meeting in the White House and shake hands. I wanted to tell them that RNAi was discovered under their administration, that the genome sequence was finished under this administration. And I think I will still go back and talk to them again if they’ll listen. But you know, fortunately we had a change in the Senate, in the House recently in the US and things politically are definitely changing. This is Ed Kennedy and I together at a congressional visit that we had recently. There’s a lot of hope I think that the US will turn things around in the near future. And begin investing in science more broadly again. Right now, if you don’t know, the US is really very tight with funding for medical research. Now I’d like to show this slide, this is Andrew Fire and I, for several reasons. First of all, if it wasn’t for Andy, I wouldn’t be here today. He’s a tremendous colleague and a great friend and we worked together on our science, we didn’t compete. In fact, our collaboration began back in the late ‘80s. We focused at that time on delivering DNA into the organism, that we both love and work on, a very tiny worm. I’ll show you a picture of it in the next slide. But the worm is so small, it’s about the size of a comma on a printed page. And so, to inject the DNA into the animal, Andy and I had to work out ways of inserting the needle into this tiny animal under the microscope. And it was something that had never been done, of course. So working together—actually we worked independently at first—but once we got to know each other we began sharing ideas. Because it was very difficult breaking in this new technology and figuring out how to handle this very tiny animal and inject efficiently into the animal. Together we described a transformation procedure for delivering DNA that worked very, very well. And really, it was a lot of fun to work with Andy. And the other reason I like this slide is because we’re not—what we’re doing here of course is, we’re on the stage—we’re not talking. You can see Andy’s mouth is closed and so is mine. But what we really won the prize for was for talking to each other, for sharing our ideas. And for not being afraid, for trusting each other and not being afraid of being scooped. And I think that’s something that we really need a lot more of, a lot more openness and willingness to share ideas. Thank you. Now here’s C. elegans swimming back and forth in the laboratory on a culture dish. These animals are extremely beautiful. As Sydney Brenner noted when he chose this organism to study, they’re essentially transparent. So you can look right through the animal and see all the cells inside and see all kinds of detail. The other thing that’s incredible about these animals is, they’re so simple in terms of their cellular complexity. They have only about 1000 cells compared to a human where we have 10 trillion cells. So they’re a really elegant system. But when you talk about worms to people, like let’s say my neighbors in Shrewsbury, Massachusetts where I live, they would always, you know, they’d be very polite at first. Oh, you work at a medical school, that’s nice. What do you work on. Worms. And then their eyes would sort of glaze over. Why would anyone work on a worm at a medical school. They just couldn’t get it. And then, thanks to Hans’ phone call, all of a sudden my neighbors, when I tell them I work on a worm, they actually listen to me. And I think that, if anything, that has been the most satisfying thing since October 2nd, is to be able to actually tell my neighbors about worms and evolution and have them actually listen. So why is it that worms have turned out to be so important. And yeast for that matter, have turned out to be so important to human biology and medicine. And this is something that the general public does not appreciate, especially in America. I think it’s less of a problem in Europe and Asia. So to answer that question I’m going to go all the way back to the Big Bang. And I took this slide from John Mather, who I’ve gotten to know quite well, he also shared the physics prize with George Smoot in 2006. And so when we were in Stockholm together the press was always asking us. What does your discovery have in common with your discovery. You know, they discovered the Big Bang, we discovered RNA interference. How do you connect those two. It’s quite a challenge. But what they did is, they used a satellite called COBE to map the cosmic background radiation that’s just everywhere in outer space. And this is the map that they put together. And what they noticed is that everywhere you look in outer space there’s a little bit of left over radiation. They measured the temperature in the spectrum and from that they calculated an age of 13.7 billion years ago for the Big Bang. And so the connection that we came up with, or that I think is really interesting to think about, is that life exists on a cosmic scale. Life on this planet arose about close to 4, 3.5- 3.8 billion years ago. During the time that life has been evolving on this planet, actually just since the common ancestor of plants and animals, the galaxy that we’re in has rotated about four times around its axis. Life itself is remarkable in its durability and the fact that it really does exist on a cosmic scale. So, let’s look at a little bit of the history of life. Here’s the common ancestor of worms and humans. Now on this side I’m showing the planet earth going through what’s called a snowball Earth event. And there’s geological evidence in the rocks, in the earth’s crust for glaciation events of this type where the earth was completely covered with ice all the way to the equator. And I think this is a very interesting concept from a biological standpoint because of what these kinds of events would do to the common ancestor of worms and humans. So here we are, the common ancestor, a sophisticated, really good, little organism capable of doing all kinds of things. It has Hox patterning, it has all kinds of fascinating things going on inside of it like RNA interference, working just great. But it has got a big problem. The earth itself doesn’t have any land. So, where is this little guy going to live. Either thermal vents or perhaps little cracks in the ice, in the ocean. So this kind of event actually happened twice and both times there were massive extinctions. So there was evidence for an extinction here and an extinction here. And then, right after that event, we have the biologic equivalent of the Big Bang. We have the Cambrian explosion. And there has never been an adequate explanation I don’t think from the biological side for the Cambrian explosion. But I think from the geologic side these glaciation events may provide a real compelling possible explanation where, what happened here was finally the ice melted, the earth became habitable, the land masses and the shallow seas around the land became habitable and you had this real amazing diversification of life. The rapid appearance of different animal groups including the group that gave rise to humans and the groups that gave rise to the nematodes. And in fact if you go back further, the origin of plants and animals would be down off the bottom of this page. But plants and animals all have RNAi and that is the thing that I think, I feel like even my neighbors get it. You know, even the people who don’t know anything about biology, they’re afraid that. Oh, we can’t be really related to monkeys. They actually get it. And I think that it’s partly because of the President we’ve had in the US that now people are accepting of this. But the fact is that we really are—you know, as Nietzsche said, we’ve made our way from worm to man but much within us really is still worm. And I think that’s a really important aspect of what I can do as a biologist to sort of get across that message of our common ancestry. Not only are we related to worms but everyone in this room is closely, closely related to each other. So mankind has to get over these nationalistic barriers and start thinking about each other as brothers and sisters. Now here’s what the little worms encounter sometimes in their real environment. There turns out there are hundreds of little fungi that live in the soil that will feed on worms. And they’ve even devised these little traps, like this one here in which you can see this poor nematode has been lassoed. And I’m going to show you this little movie where you can actually see this happen. These are worms that have already been captured. But watch this one here. It’s going to swim through there and it just closes right on his tail. Here, watch this one too, there’ll be another worm coming in here. This is what they’re exposed to naturally in the environment. These animals encounter all kinds of predators. And watch, they’re just closed. I don’t really know how the fungus can sense the nematode. But it has a trigger mechanism that senses the motion. And when that happens the worm gets trapped. And then the fungus sends hyphae into the animal’s body and digests it from the inside, a terrible fate. And this drama plays out every day as you’re walking to work. There are 10 to the 9 worms per cubic yard of soil. And you don’t even realize that they’re struggling to survive as every day. A lot of you have seen this movie. In fact I was talking to several of the students from China, I think everyone in China has now seen my talk. So this is my—supposed to be— my funny slide. I have to wait for CBS News to do another documentary or something on RNAi because they provide such great material. This is the CBS News 15 second explanation of how RNAi works. Watch carefully. Here’s the double-stranded RNA. Now here are the defective genes. I can see some of you didn’t see this already, I’ve shown this so many times, I love it. Many people didn’t know that defective genes look like cheese puffs. And probably you didn’t know that the RNA can actually chew. But this is why Andrew Fire and I knew that we had to work on this mechanism. It was such an exciting problem. I’ll come back to this at the end, there are some elements of this that are actually correct. And in fact, the thing that I think is really interesting is that—even though, of course the genes don’t actually look like cheese puffs—RNA can, RNAi can direct the chromosomal elimination of DNA. If you look at the Tetrahymena as an example where the RNA is guiding chromatin modifications that then are recognized by enzymes that catalyze the cleavage of the DNA and the elimination of the DNA during the process of macro nuclear formation in the Tetrahymena. The other thing about this of course is that they’ve illustrated it as an active mechanism. And I’ll come back to that in a moment. This is another movie from NOVA. So, in this case another nice little movie. This is from NOVA scienceNOW and the movie itself is 15 minutes long, so quite a bit longer than the CBS segment. It’s actually a fairly nice movie because it gets across, even for children the concept of RNA interference as a surveillance mechanism that can silence viral genes in this case. And there’s clearly some evidence that in multiple different organisms RNAi can serve that kind of function. But even my seven year old daughter doesn’t believe that there’s a cop inside of every cell, so I think this is a safe analogy or metaphor if you will. Whereas the CBS metaphor I think is a little pseudo scientific and people might actually believe that RNA can chew and that could be bad. But this one I like a lot. Now, here’s one more movie and this is from nature. This is just like the Star Wars version. We’re flying into the nucleus of the cell here and now we’re flying along the DNA. The DNA is all super coiled there. And now it’s opened up and the polymerase is going to get on here and start making a message. This is transcription occurring. This is a movie that is very useful for high school kids and lay people who aren’t familiar with basic biology. That’s the capping of the message. This is the RNA getting spliced here. Now it’s going to be transported out of the nucleus, that’s polyadenylation. And the message is going to go out, here it comes. Now, a scientist is about to inject the RNA into the cell. If you watch, you’ll see. Oh, here’s the ribosome making protein from the message. Here’s the scientist injecting the double-stranded RNA, it should be an A form helix, not that. It’s getting cut, that’s Dicer which cuts as… Now, here’s the slicer enzyme or argonaute and this will go away, it won’t chew, don’t worry. The beauty of this is it can use—this protein complex can use the sequence information here to find perfect matches. And it can do that catalytically, so it can go on and on and on and silence thousands of transcripts. It really is remarkable. But one way that I like to describe RNAi to the lay audience is. Imagine having the internet, but no way to search it, you have no search engine, no Google, no way to find anything. That’s really the way I figure your genome would be if it wasn’t for a mechanism like RNAi. RNAi uses a little search sequence, small sequence, just like you would type into the window of your Google browser to find genes or sequences, messenger RNAs or even DNA in the cell and regulate it. And the beauty of that type of mechanism is it can coordinate related—the regulation of related genes that are separated in multiple places in the genome. So, the reason we wanted to study RNAi is we noticed that it was remarkably potent. And in fact, when you inject RNA into the worm, the first thing we noticed is that the silencing effect could be inherited. So it could be transmitted via progeny that were carrying the silencing effect producing effective progeny after a full generation. And it could even be transmitted via the sperm and effect progeny after a subsequent generation. And if you keep selecting for effected progeny this silencing effect can be inherited, apparently indefinitely in C. elegans. And this is something that we’re still very interested in understanding because this long term inheritance must reflect some sort of change at the chromatin level, most likely. It’s also systemic in that the injected RNA can spread throughout the animal. So you can put RNA into the intestine for example and the silencing effect can be observed inside the germ line. So there’s a way that these RNA molecules can move from cell to cell. And that’s something we need to learn a lot more about. When we noticed these phenomena we realized that there was an active response in the animal. As I said, the movies I showed you all have some active process. Either the cop or the RNA chewing, there’s some response in the animal to the double-stranded RNA. And for example there appears to be a transport mechanism, the silencing mechanism itself and then the amplification mechanism or the inheritance mechanism. And we still don’t understand many of these steps. But when we began working on this in C. elegans, there was an obvious approach to take to try to understand these mechanisms. And that is to use genetics. The first person to do RNA interference genetics was Hiroaki Tabara in my lab. And he set up a very elegant screen back in 1997, early 1998 in which he mutagenized animals and then placed them on bacteria expressing an essential worm gene. Now the worms are so sensitive to double-stranded RNA that they can eat it in their food and experience silencing as a result. Silencing that’s so potent that if you target a worm gene that’s essential, it will kill every egg in the wild type worm. So a gene for example required for embryogenesis can be targeted by feeding this animal bacteria that expressed the double-stranded RNA. They eat the bacteria, they silence the gene, all the eggs fail to hatch. So Hiroaki set up a very simple screen where he just looks for animals after two generations where the progeny are viable and by doing so he found lots of interesting genes involved in the RNAi mechanism. And I’ll just skip way ahead because I know I don’t have a lot of time today and tell you about the cop. The cop gene was—just so happens—was the first gene that Hiroaki identified. He named it RNA deficient gene number 1 or rde-1. And it’s now called after the first plant gene that had been identified in this family as a developmental defect in plants. The enzyme is shown here in grey in its protein structure, crystal structure that was done by Leemor Joshua-Tor and Ji-Joon Song in 2004. What you can see here is the guide RNA, the silencing RNA and the messenger RNA base pairing inside this groove in the enzyme. The base pairing event that occurs here pushes the messenger RNA up against the catalytic centre. This domain encodes an RNase H related fold that then cleaves the messenger RNA. And this is then discarded and the siRNA is allowed to then go on and silence more genes. We call these short interfering RNAs or siRNAs. They can catalyze multiple reactions like this. The thing that is funny about the RNAi field is the people who work in it obviously watch too much TV, especially the late night TV. Probably when they come home from lab the only thing on late at night are those shows that have lots of commercials for things like the Ginsu knife. Because we named the enzyme that’s upstream, is called Dicer and this one is called Slicer, so it dices and it slices. And if you’re from America, you’ve seen these commercials where they’re selling you this knife that will cut all kinds of different ways. But the thing that’s funny about those commercials is they always end—when you’re about to buy the knife, they always say there’s more, then they try to sell you the steak knives that go with it. And that’s the way it’s been working on RNAi. Every time you think it can’t get any cooler than this, something really, really interesting comes along and that’s what it’s been like. So we cloned rde-1 back in 1999. And for Andy and I that was like the eureka moment for us. Before that the fact that double-stranded RNA could trigger silencing was just phenomenology. It was interesting, but we didn’t know for sure that it was conserved or if it was just a worm thing or whether other animals would have the same kind of response. But when we cloned rde-1 we found that it was a highly conserved gene with multiple homologues. And this is just the family tree of rde-1 related proteins in the different animals. So, these are worm homologues here in red, these are other worm homologues over here and more worm homologues over here. Now it turns out humans have eight copies of the rde-1 gene, there’s four here and there’s four human genes over here. So, if you look at this, what you see is the black group of argonautes are the oldest branch of the family. These even have plant homologues in this area over here. But there are animals—almost all metazoan animals have two families. this one over here and this one over here which we call the Pee-wee family of argonautes. So the common ancestor of worms and humans already had at least two argonaute genes. When we cloned rde-1, because of the genome sequences we got all of this other information. And this is the beauty and the power of this genomic era that we’re in. You clone one gene in a model system like C. elegans and all of a sudden you have all the genes in all the organisms that have ever been sequenced. But this allowed us to ask the question. What did these highly conserved genes do. And so Alla Grishok in the lab knocked out these two genes and then analyzed the phenotype. To give you an idea of how exciting her discovery was, I have to tell you a little bit about Victor Ambros’ work. In 1993 Victor published a paper describing a little gene lin-4. The lin-4 gene had this very interesting nature in that it folds into a hairpin-like structure. And Victor described two forms of the lin-4 product. One is a 70 nucleotide precursor form that’s in this hairpin shape and the other is a 21 nucleotide RNA. So this is a naturally occurring worm gene, identified as a gene that regulates another worm gene called lin-14 that was analyzed by Gary Ruvkun’s group. Together Victor and Gary’s groups, together they worked out that lin-4 is a negative regulator of a gene, lin-14 that has complementary sites in its three prime UTR. This was the first gene which we now refer to as microRNAs, this was the first microRNA. In 1993 it was just another one of these weird things worms do. And in fact in 1994 I think Victor was denied tenure at Harvard, despite making this really exciting discovery just the year before. Everyone was very surprised. But the fact is that there was a strong bias that this was just an unusual thing that worms did and maybe it’s not relevant to humans. But something happened between then and 2000. In the year 2000 Gary Ruvkun’s group cloned the let-7 gene. And what had happened between ’93 and 2000 is we had enough human DNA sequence by that time, that you could look—Gary’s group looked and he found a perfect homologue of let-7 in the human genome sequence. So the entire 21 nucleotides in the human is identical to the 21 nucleotides in the worm. And in fact what they found is that every metazoan animal has a let-7 gene. And again let-7 seems to regulate targets by interacting with the three prime UTR. But the thing that was missing still, despite the fact that these are about the same size as siRNAs, the question remained. How are these pathways really related. Is the RNAi pathway related to the microRNA pathway or not. And Alla’s result suggested for the first time that the two pathways are related. And what she showed is that mutations in Dicer and mutations in those conserved argonautes have defects in the processing. Here’s the wild type, but in the absence of Dicer or this argonaute there’s a defect in the processing of this precursor and there’s less of this mature form accumulating in the animal. So the RNA interference mechanism which is involved in silencing genes - we use it experimentally, but it has a role also in transposon silencing and so on - has a conserved role in gene regulation, in which the worm makes double-stranded RNA by encoding it with just regular genes that then are processed into these siRNAs and can go on to regulate their targets. That was extremely exciting. And now it’s even getting more exciting in that these microRNAs are turning out to have really important roles developmentally, including some very important links to cancer biology in humans, including links in which the microRNAs are involved in preventing cell division and in suppressing cancer, sort of a tumor suppressor role for the microRNA genes or are chimiric genes, genes that promote cell division. This is a figure from Carlo Croce’s lab. It turns out that these are different patient samples and these are a set of about 100 microRNAs from the human. What they’re doing here is looking at the gene expression profile in different patient samples on this axis. You can see that certain microRNAs are up regulated in some tumors and down regulated in others. By looking at these profiles it’s actually turning out to be possible to make predictions about how a particular tumor will respond to treatment. In addition some of the microRNAs that are identified as correlated with an oncogenic state are turning out to be potential targets for suppressing tumor growth. Here’s where there’s even more. And I think that this is where the lab is still working. I’m just going to show a few slides from the work of Wai Fong who has been a new post doc in the lab. What you see here is a gel where these are tRNAs. We’re looking at RNAs. And if you look way down on the bottom of the gel there are RNA species that are here that everyone always thought was just junk. But it turns out that this is where the microRNAs run, right down here, there’s a band here that Wai Fong noticed was missing in these mutants. These are mutants that are deficient in RNAi. This is Dicer here which is required for the microRNA pathway. And you can see this band here is present in Dicer, it’s present in wild type but it’s missing in these mutants here. These are all mutations in a gene called DRH-3, Dicer-related helicase 3. Now it turns out these siRNAs are triphosphorylated, whereas Dicer, when it cleaves it, makes a monophosphate at the end because of its enzymatic action. Triphosphates would be put on by a polymerase and we believe these siRNAs are the products of a polymerase. This species here, the microRNAs are here but there’s also some other species of small RNA that’s got a 3 prime modification of some kind and we’re still analyzing those. Here’s an example of one of those, these are what we call natural endogenous small RNAs. They’re different from microRNAs in that they’re not encoded by a hairpin-like structure. This is a gene called K02. In wild type the messenger RNA for this gene is present at a low level and there’s a lot of siRNA present in the wild type animal. In the mutants that Wai Fong analyzed, the messenger RNA is now expressed at a higher level and the siRNAs are gone. So, these are naturally occurring silencing RNAs that are targeting one of the worms own genes and we don’t know why. So Wai Fong devised a strategy for sequencing these. This is just an example of how these siRNAs map from some of Wai Fong’s sequencing data. We’re just starting to sequence on a very high throughput level. Small RNAs from throughout the worm’s genome to try to find out what genes are targeted by these natural silencing RNAs. You can see this particular gene which has this long name here, has hundreds probably— or thousands of siRNAs in every cell that target the whole gene. And we don’t know how these are generated or why they exist and how they function in the animal. But we do know that out of some 6000 siRNAs that we’ve analyzed of this type we’ve identified already 3000 different genes. So most genes have just a few siRNAs targeting them in the samples that we’ve analyzed so far. So we think that this may turn out to be a very important regulatory mechanism for genes in the worm. So is it just another worm thing or not. Well, this is a mouse and this is based—we just did this experiment ourselves in our lab. But last year there were three or four papers on something called the piRNAs. These are extremely abundant in the mouse and the piRNAs are actually siRNAs that are 30 nucleotides, they’re bigger than the 21. They are 30 nucleotides long. They are so abundant that they are a blazing signal on ethidium stain gel. And it’s amazing that no one ever noticed these before. But they turn out to be interacting with the Pee-wee class, argonautes. That’s why they call them the piRNAs. And their functions are still being worked out. They appear to have a role in transposon suppression but they may have a more general role in gene regulation as well. You can probably barely see it, but here’s the band that Wai Fong has been analyzing. And there are bands here in the mouse that are similar in intensity. So there’s a lot out there still to be worked out in terms of how these small RNAs are regulating development. I’m going to come back now at the end of my talk to this concept of how the RNAs interact with the DNA. Here’s the double stranded DNA. The reason I show that slide is with the discovery of DNA I think molecular biologists sort of became overconfident. We thought we had figured out how life works, we thought we understood how information is stored inside of ourselves. The DNA explains a lot, it can explain Mendelian segregation of traits. And it can explain how the genetic material is replicated and how mutations could arise. So it’s a very powerful paradigm but I think it sort of made us overconfident. And I think RNAi is sort of bringing us back to reality a little bit. DNA doesn’t really look like that in the cell, it’s wrapped up and bundled into these higher order structures. This is a 30–nm fiber, these are the nucleosomes and here’s a crystal structure model showing the histone proteins inside and the DNA wrapping around. This is another picture here where the DNA goes around just about two times. And these little tails stick out from the histones and these tails, as you may know, are targets for multiple types of regulation. They can have a role in activating or repressing the transcription of the DNA that’s wrapped around those nucleosomes. And this information that’s put here by proteins that modify these tails is very interesting to me because it seems that siRNAs can guide these modifications by bringing to the chromatin remodeling complexes and proteins that recognize these histone tail modifications. So with that type of interaction between the chromatin and the RNA you can imagine that the DNA is more like the hardware in a computer. And that the proteins and the RNA that regulate, that interact with these histone tails are like the software. The analogy I like to make is that we think of ourselves as differentiated, right. We all have the same genome in every cell but the cells do different things. Well, why do they do different things. They do different things because the DNA, different genes are on and different genes are off and they’re on and they’re off very stably. And that’s how we remain stably differentiated creatures. The thing that I’m very interested in right now is a concept that we’re just trying to figure out how to test in the lab, that the germ line itself can differentiate and that that differentiation process allows the germ line to evolve without any changes in the underlying nucleotide sequence. So you could imagine heritable changes at this level that are maintained through the interactions with siRNAs over multiple generations. If you look back at the history of thinking on evolution prior to DNA—and this is actually going back to the turn of the century— Weismann’s theory of inheritance, he named the genes biophores. Unfortunately we all like jargon a little too much, so his word for genes was biophores. But he envisioned genes that could be replicated many, many times per cell division, not just once. And they could be segregated unequally between cells. He thought this could explain differentiation and development. And he came up with this concept of biophores which was cast aside after Mendel’s discoveries. But when you read Weismann’s theory, if you put instead of biophore the word siRNA, everywhere he used the word biophore. His theory works beautifully. So, I think we have to go back and think about evolution again and development. Darwin went even further than Weismann and came up with a word gemmules. And these were able to exit the somatic cells and enter the germ line and cause heritable changes that were… I see Hans standing up, that’s a bad sign. So I’m going to cut it short. But RNA could be, RNAi, maybe we should rename it RNA information because the RNA can guide the regulation of the DNA. Now, here’s Hans. I’m asking him to call me any time. He’s the one who makes the phone call by the way. So be nice to him. Here’s Andy and his wife Rachel. This is the class of 2006, there’s John Mather and George Smoot over there, Orhan Pamuk, Rodger Kornberg, Ed Phelps, Muhammad Yunus and a representative from the Grameen Bank. This is just a family photo with my daughter Melisa and Victoria who are here at the meeting. Here’s my wife getting some advice on economics at the banquet. And here she’s giving some advice. During the banquet Ed called my wife a communist—she grew up in Hungary. And here’s George explaining the Big Bang to me. And you can see I have this glazed look on my face because you know I think it’s a nice story but believe me there’s a lot of mysteries still in that story. And here is Victoria collecting some gold medals, these are very nice gold medals because they have chocolate inside. And here is Vickie dancing with me, it was a wonderful time there. This is the danger of one of these prizes, you can see I’m signing a chair at the Nobel Museum and you can see what's happened to my body, my head is huge and my body has gotten very small. So that’s one of the dangers. But, and I’ll tell you there is a real antidote for that and I’ll just end with this slide, this is Tara Bean, in 1998, this is her picture. She was diagnosed with a brain tumor because of vision problems that she developed in third grade. She grew up in my home town, we know her family and she was seen at the hospital where I work. And she unfortunately lost her battle with cancer. And since her death we’ve learned a lot about the basic mechanisms of cancer. We have a lot more to learn. There’s a lot of tremendous exciting work going on and a day doesn’t go by now, even here at this meeting when I don’t get an email of some kind from somebody who has got a sick loved one, someone who thinks that maybe RNAi could help them. And unfortunately the answer is still that those cures are perhaps years away and it’s very hard. So we got to get back to work, as soon as the meeting is over everybody get back to work and try to come up with some new cures. And I think I’ll end there. Sorry, I always go long. Thank you very much Craig, it was a wonderful lecture and we now learn also about the future. I felt like a bad boy walking up and interrupting you. But since we said we should have some questions and further extension, I thought we should do so. So, now this lecture is open to questions. I saw your hand first. I was promised that we have a microphone. Yes, she has one. My name is … (inaudible 50.05). I’m a medical doctor from Pakistan. You mentioned that RNAi can cause chromosomal elimination of DNA. So, is it therapeutically possible by injecting bacteria or viruses expressing double-stranded RNA to silence genes involved in the pathophysiology of cells in tumors or cancers in humans or mouse models. Well, potentially. But those silencing approaches that are being attempted now in the human are not designed to eliminate the DNA corresponding to the target gene. You can achieve knock down reduction in gene expression of a gene in a human cell using RNAi. And that is being developed as a therapeutic strategy now in multiple different companies around the world. And it’s even in human trials right now for several different indications. So it looks like it’s going to be a viable approach, whether or not you’ll ever be able to actually target the elimination of a gene effectively in a patient, I don’t know, and you may not even want to do that in most cases. So that’s probably not possible. Questions. I saw another hand very closed by and one hand over here. This is really amazing and I’m really sensitized. But in the beginning of your lecture you mentioned the importance of politics in science and I want to agree with you absolutely. I also noticed that this is a long journey what you are presenting today. And what I’d love you to mention is how much this costs, because I’m really interested in economy and this must have cost a lot of a fortune. And I know that the Bush administration has put a lot of limitation on Africa research because he felt we should not waste money on research, we should face poverty. And some of us felt research is another way out of poverty. From your experience, what would you say to this comment. Well, I’m not sure I understood your question completely. But let me just say that the kinds of drugs that you can make with RNAi, using RNAi as a drug, are going to be so expensive and so tailored to individuals that they have a lot of potential. But I really doubt they’ll penetrate to more than a few percent of the world’s population. The easy to deliver drugs are pills. And if you can develop orally available small molecule, then you can really get drugs inexpensively into patients. RNAi is being used to help discover pathways and so on, to find new druggable targets. But RNAi as a drug I think is going to be very hard to get into the Third World as a therapy because it’s an injectable. So it’s somewhat more difficult. I think that’s actually one of the things that we really need to fix. We can spend a lot of time trying to cure diseases that have never been cured. But in a lot of the world the diseases—it’s just malnutrition and diarrhea that are killing most of the people, or malaria or some well known disease that’s treatable. And the medicines are not there because of political instability or infrastructure problems. These are the kinds of things that I think require an interdisciplinary effort to try to solve medicine. We can continue to go along these paths towards more and more complex, more and more specialized medicine without benefiting mankind. Nearly as much as we could if we invested some time in helping to bring—really to reinvent economies that work for the Third World and we’re not doing that. So I think that sort of answers your question. Thank you. And then it was you, yes. Hi, I’m Shawn from … (inaudible 54.16) UK. So, I had a question, looking at the system biology aspect. I always used to think about this problem, like how the cell in terms of system biology decides which part for small RNA you should take. Like if you have viral response you have mRNAs or you have saRNA mechanism. So in terms of the wall cell concept, how would cell choose the mechanism for RNA defense. I have no idea. It’s a very interesting question. But you know, the regulation of these mechanisms is something that really just hasn’t been worked out yet. We don’t know how microRNAs really work and how they regulate their targets. We don’t even know how they—probably because they have multiple ways of silencing—we don’t know which one they—how they choose, how to either cleave the gene or just silence it or send it to a storage place. You know there are a lot of possibilities. One of the things though that's very exciting about RNAi is for the eukaryotic cell. I think it provides a mechanism for linking transcription and translation so that the cell can, while its transcribing a message, mark that message for storage and use later. A concept that would allow the cell, despite the existence of the nuclear envelope to export a message that’s been marked for use later. And that’s a really interesting concept. So there are all kinds of interesting possibilities about regulation. I think it’s going to take years to sort it all out. Any more questions. I saw your hand and then yours. I don’t think Hans can see further than … Well, thank you.(laughter) My name is Matthew Albert from INSERM in France. I’m curious to know about double-stranded RNA and single-stranded RNA with 5-prime-triphosphates. They’re known as immune adjuvants, signaling through pattern recognition molecules like toll-like receptors and intercellular helicases. I was curious to know whether or not worms have a similar mechanism for immune activation. And how you imagine sort of cell versus viral RNA could be recognized in different ways that would avoid aberrant immune responses. That’s a great question. And in fact the Dicer-related helicase that I was referring to is a homologue of RIG-I, MDA-5 and LGP-2, which all are members of the Dicer family of helicases. That's our name for it, Dicer-related helicases. But the fascinating thing about that is that those are all involved in the human innate immune response in anti-viral response. And recently the Dicer-related helicase, human versions have been linked to recognition of triphosphorylated, not siRNAs but viral products that are triphosphorylated. So there’s a homology really between the anti-viral mechanism in humans and the RNAi mechanism in worms. The worms have retained a very potent sequence specific response. The human has either lost that response or it’s much less important or it’s only in certain cell types, we don’t know which. The human cell when it recognizes a viral process will commit suicide and these same receptors are involved in recognizing the viral replication products and then activating an apoptotic pathway. So, a very efficient way to get rid of a virus if you have 10 trillion cells but if you’ve only got 1000 you better not kill the cells. So the worms may be very good at the sequence specific aspect of anti-viral or silencing. So the homology and the similarities between those mechanisms are fascinating and in fact it turns out that those LGP-2 of the three human members of this family interacts with Dicer and with another protein that we’ve identified in the worm called pure 1. It’s a phosphatase that recognizes triphosphates and removes two to make a monophosphate. There is a complex in the human that appears to have at least those three proteins. So we think that the human cell may have this mechanism as well. And we’re still trying to sort out how the human does the sequence specific silencing. Then I promised you. And after that we go further away. My name is . (inaudible 59.16). I’m from India. What I wanted to ask you was if you’re using RNA interference in the cure of cancer or the battle against cancer. Is there a mechanism or is there a method to make RNA cell-specific to suppress mitosis in the cancer cells. Is there a specific way to just target the cells in there. Because the mitotic mechanisms are the same in normal cells as well as cancerous cells. Right, cancer is a very challenging target for an RNAi therapeutic. And getting it delivered to the tumor specifically would obviously be a very important aspect because if you’re trying to interfere, say with mitosis, you’d kill the healthy cells as well. The same problem with many cancer therapies. So, it’s a problem again that hasn’t been solved. But one that people are working on. There are possible solutions but I don’t have any for you at the moment. Could we possibly get the microphone over here. Worms are extraordinarily sensitive to RNAi. I mean, they’re sensitive to it in their food. What do you think the evolutionary advantages of evolving such a sensitivity would have been. I mean, considering you don’t have this in other organisms. Why are they so sensitive that they can actually transmit it in their food. It’s very interesting. You know, these worms are hermaphroditic, they’re also capable of fertilization, cross fertilization by males. But they colonize food in the soil, quite often an individual worm will find the food and have to populate the food source without a mate. So they’ll self fertilize and make thousands and millions of progeny. When they begin to starve they do something very interesting. These mothers are very altruistic, they actually hold on to their eggs when they’re starving and they allow the eggs to hatch internally. That way the progeny hatch in the presence of an abundant food source, the mother. And then they consume the mother, they reach an age that’s old enough to become a dower larva which is a very resistant form and then they can go off in the soil to find new sources of food. The interesting thing there though is that if an animal is starving and allows the progeny to eat itself, it might have developed immunity against viruses during its lifetime that could then be transmitted to the progeny via feeding. That’s one explanation that I’ve just sort of back of an envelope idea. But I think it’s possible that—because of the way they live, they want to be able to transmit these silencing activities to their progeny. The sort of embarrassing aspect of this is that C. elegans researchers So we don’t know of any viruses that we can use to sort of test this model. There are no viral, existing viral examples from nematodes. Maybe they’re so good at silencing them. Probably it’s just not a stable interaction in the laboratory. So we lose them very quickly. Thank you very much. I’ve just thought, I should say we stop. But a final question to you. You can shout it out. I’ll hear it. Concerning the use of siRNA and therapy. Isn’t there a problem between the high specificity of siRNA and the allele variation of defective genes. For instance by using shRNA to fight against AIDS, there are a lot of HIV mutants. So, how would you imagine. Well, you could target cellular genes which are less apt to mutate, that’s one strategy. And of course you can design an siRNA against the region of the genome that for some reason can’t mutate very often. And those strategies are being tried. I think there’s an HIV trial now using gene therapy to deliver the silencing RNA. That’s either approved or will be shortly in the US. So they’re trying that approach even for HIV. But normally there’s not that much allele variation so you can choose a region. That’s not for normal genes. For viral genes—yes, there are. But for normal cellular genes there is less variability. So you can choose an siRNA that will target a conserved region. Interestingly, in the case of a dominant mutation for example that’s causing a phenotype, you can even design your siRNA so that it will only target the mutant allele. And that’s with some degree of selectivity, you can get silencing specifically of the mutant allele by designing the siRNA. So that it won’t cleave the wild type allele but only the mutant. So there’s a lot of possibilities still for using RNAi as a therapeutic. Thank you very much.

HANS JÖRNVALL. Ich glaube, wir sollten versuchen, anzufangen. Es ist 9:00 Uhr und ich heiße Sie alle zum Beginn der diesjährigen Vorträge herzlich Willkommen. Es gibt bereits bei unserem ersten Vortrag eine kleine Änderung, denn Sir John, der als dritter Redner hier bei uns sein sollte, konnte nicht kommen. Daher haben wir die folgende Entscheidung getroffen: Die drei übrigen Vorträge werden um jeweils etwa 5 Minuten verlängert. Außerdem werden wir nach dem ersten Vortrag ein Experiment wagen und eine Fragerunde mit dem Publikum anschließen. Und mit diesen Fragen und der Verlängerung der Reden werden wir zu unserem normalen Zeitplan zurückkehren. Wir werden nicht alle Vorträge mit einer Fragerunde beschließen, aber da der erste Vortrag von unserem jüngsten Nobelpreisträger vom letzten Jahr gehalten wird, haben wir uns entschieden, die Runde nach dem ersten Vortrag zu machen. Und nach dem ersten Vortrag und dieser Fragerunde gibt es außerdem eine Kaffeepause. Wir machen also Kaffeepause zwischen 10:05 Uhr und 10:40 Uhr. Wir machen dann anschließend 10 Minuten früher weiter, damit auch der zweite und dritte Sprecher zu ihrer Verlängerung kommen. Damit sind wir dann auch bereit anzufangen. Der erste Sprecher ist Professor Craig Mello von der University of Massachusetts, der Medical School in Worcester, USA. Er bekam den Preis, wie ich gerade sagte, letztes Jahr. Er bekam ihn für die „Entdeckung der RNA-Interferenz – Gensilencing durch Doppelstrang-RNA“. Bitte, Professor Mello. Danke. CRAIG MELLO. Danke, danke Hans. Es ist eine Freude und eine wirklich große Ehre hier zu sein. Ich freue mich schon auf die Gelegenheit, viele Gespräche und Diskussionen mit allen Anwesenden hier im Laufe der nächsten paar Tage zu führen. So, lassen Sie mich fortfahren und mit meinem Vortrag beginnen. Ich habe meinen Vortrag ein wenig umbenannt: Ich fahre also fort und beginne meinen Vortrag mit einer etwas ungewöhnlichen ersten Folie hier. Ich weiß nicht, ob Sie – könnten wir etwas weniger Licht haben? Das sind Dick Cheney und ich im Weißen Haus. Wenn Sie einen Preis wie diesen verliehen bekommen, besteht einer der besonderen Vorteile darin, dass man Führungspersonen des Landes oder Leute auf der ganzen Welt trifft, die eine wichtige Rolle in der Politik spielen. Könnten Sie die Bühne ein wenig abdunkeln? Ich glaube, es ist zu hell. Können Sie das gut erkennen? Sie sehen, dass ich nicht sehr dicht bei ihm stehe. Seine Wählergunst in den USA liegt zurzeit bei etwa 7 %, er ist der Vizepräsident, aber Viele denken, er ist der kluge Kopf. Wichtig jedoch, und der Grund, warum ich dies zeige, ist, es ist sehr wichtig, zu wählen und sich in die Politik einzubringen, wissen Sie, egal, ob Sie ihn gewählt haben oder nicht. Nun, wenn Sie in Ihrem Land nicht wählen können, und einige können das wahrscheinlich nicht, dann ist es sicherlich wichtig, jeden aufzuklären, mit dem man spricht, Leute darüber aufzuklären, was in der Welt vor sich geht. Sprechen Sie mit Leuten, das ist sehr wichtig. Und eines der Themen, die ich für wichtig halte, und das wir hier diskutieren sollten, ist, ob es vielleicht klug ist, die Treffen in Lindau zukünftig immer interdisziplinär abzuhalten. Denn ich glaube, eines der Dinge, die in der Wissenschaft gerade vor sich gehen, ist, dass sie bereits sehr interdisziplinär ist. Biomedizin zum Beispiel hängt stark von Physik und Chemie ab, glaube ich. Aber auch politische Themen sind sehr wichtig. Daher halte ich es für sehr wichtig, an der Universität und auch bei Veranstaltungen wie dieser einen sehr interdisziplinären Fokus zu haben, um zu versuchen, den Dialog in Gang zu bringen. Ich ging nach Washington DC in der Hoffnung, der Bush-Regierung mitteilen zu können, wie wichtig RNA-Interferenz als Technologie ist und wie gut es zum Genomsequenzierungsprojekt passt, und wie beides zusammen, gemeinsam mit anderen großartigen Technologien, eine wirkliche Veränderung in der Art und Weise herbeiführen, wie wir Medizin handhaben und praktizieren. Und wie sich dadurch viele Gelegenheiten für neue Arten von Medizin ergeben, die Verknüpfung von menschlichen Krankheiten mit der Genetik. Leider kam es nur zu einer sehr kurzen Zusammenkunft und einem Händeschütteln im Weißen Haus. Ich wollte ihnen mitteilen, dass die RNAi unter ihrer Regierung entdeckt wurde, dass die Genomsequenzierung unter ihrer Regierung fertiggestellt wurde. Und ich glaube, ich werde trotzdem noch einmal hingehen und erneut mit ihnen reden, falls sie zuhören. Aber wie Sie wissen, hatten wir glücklicherweise einen Wechsel im Senat, im Haus kürzlich in den USA und politisch ändern sich die Dinge definitiv. Dies sind Ed Kennedy und ich zusammen bei einem Besuch des Kongresses, der kürzlich stattfand. Es gibt eine Menge Hoffnung, glaube ich, dass sich die Dinge in den USA in naher Zukunft ändern werden und das Land anfängt, wieder mehr in die Wissenschaft zu investieren. Im Moment, was Sie vielleicht nicht wissen, gibt es in den USA kaum finanzielle Unterstützung für medizinische Forschung. Nun möchte ich Ihnen diese Folie, das sind Andrew Fire und ich, aus mehreren Gründen zeigen. Erstens, wenn es Andy nicht gäbe, wäre ich heute nicht hier. Er ist ein toller Kollege und ein großartiger Freund. Wir haben zusammen gearbeitet an unserer Wissenschaft und haben nicht miteinander konkurriert. In der Tat begann unsere Zusammenarbeit Ende der achtziger Jahre. Damals konzentrierten wir uns darauf, DNA in den Organismus einzuschleusen, den wir beide lieben und mit dem wir arbeiten, ein winziger Wurm. In der nächsten Folie zeige ich Ihnen ein Bild. Aber der Wurm ist so klein, ungefähr von der Größe eines Kommas auf einer Druckseite. Um die DNA in dieses Tier zu injizieren, mussten Andy und ich uns Wege ausdenken, die Nadel unter dem Mikroskop in dieses winzige Tier einzuführen. Und natürlich war das etwas, was noch nie zuvor getan worden war. Wir arbeiteten also zusammen – eigentlich arbeiteten wir zuerst unabhängig voneinander – aber nachdem wir uns besser kennengelernt hatten, begannen wir, Ideen auszutauschen. Denn es war sehr schwierig, sich in diese neue Technik einzuarbeiten und herauszufinden, wie man mit diesem sehr kleinen Tier umgehen und effizient eine Injektion in dieses Tier durchführen könnte. Zusammen beschrieben wir einen Umwandlungsprozess zum Einschleusen der DNA, der sehr, sehr gut funktionierte. Und es machte wirklich eine Menge Spaß, mit Andy zu arbeiten. Und der andere Grund, warum ich diese Folie mag ist, weil wir nicht – was wir hier machen ist, natürlich sind wir auf der Bühne – weil wir nicht sprechen. Sie können erkennen, dass Andys Mund geschlossen ist, genau wie meiner. Wofür wir den Preis aber wirklich verliehen bekamen, war dafür, dass wir miteinander redeten, dafür, dass wir unsere Ideen austauschten. Und dafür, dass wir keine Angst hatten, dafür, dass wir uns vertrauten und keine Angst davor hatten, ausgenutzt zu werden. Und ich glaube, das ist etwas, das wir häufiger brauchen, viel mehr Offenheit und Bereitschaft, Ideen auszutauschen. Danke. Nun, hier sehen Sie C.elegans, wie er im Labor in einer Kulturschale hin und her schwimmt. Diese Tiere sind äußerst schön. Wie Sydney Benner bemerkte, als er diesen Organismus für seine Studien auswählte, sie sind im Wesentlichen durchsichtig. Man kann also gerade durch dieses Tier hindurchsehen und alle Zellen darin erkennen und alle möglichen Details. Und was bei diesen Tieren noch so unglaublich ist, ist die Tatsache, dass sie in Bezug auf ihre zelluläre Komplexität so einfach sind. Sie bestehen aus lediglich 1.000 Zellen im Vergleich zum Menschen mit seinen 10 Billionen Zellen. Sie bilden also ein sehr elegantes System. Aber wenn Sie mit Leuten über Würmer sprechen, wie etwa, sagen wir, mit meinen Nachbarn in Shrewsbury, Massachusetts, wo ich wohne, sind sie immer, wissen Sie, sie sind immer sehr nett zu Anfang: Oh, Sie arbeiten an einer Medical School, wie nett. Woran arbeiten Sie? Würmer? Und dann werden ihre Augen, na sagen wir glasig. Warum sollte sich jemand an einer Medical School mit Würmern beschäftigen? Sie konnten es einfach nicht begreifen. Und dann, dank des Telefonanrufs von Hans, hören plötzlich meine Nachbarn, wenn ich Ihnen erzähle, dass ich an einem Wurm arbeite, sie hören mir tatsächlich zu. Und ich glaube, das war, wenn überhaupt etwas, das Befriedigendste seit dem 2. Oktober, nämlich meinen Nachbarn tatsächlich etwas über Würmer und Evolution erzählen zu können und sie hören zu. Warum also haben sich Würmer als so wichtig erwiesen? Und Hefe, was das betrifft, hat sich als so wichtig für die menschliche Biologie und Medizin erwiesen. Und genau das ist etwas, das die Allgemeinheit nicht zu schätzen weiß, insbesondere in Amerika. Ich glaube, in Europa und Asien ist das kein so großes Problem. Und um diese Frage nun zu beantworten, gehe ich ganz weit zurück bis zum Urknall. Ich habe diese Folie von John Mather geborgt, den ich ganz gut kennengelernt habe, auch er bekam 2006 den Preis für Physik zusammen mit George Smoot. Als wir zusammen in Stockholm waren, fragte uns die Presse dauernd: Was hat Ihre Entdeckung mit Ihrer Entdeckung gemeinsam? Sie wissen, sie haben den Urknall entdeckt, wir die RNA-Interferenz. Wie bringt man diese beiden Dinge in Zusammenhang? Das ist eine ziemliche Herausforderung. Aber was sie taten war, sie verwendeten einen Satelliten mit Namen COBE, um die kosmische Hintergrundstrahlung zu kartieren, die im Weltraum überall zu finden ist. Und das ist die Karte, die sie erstellt haben. Sie erkannten, dass, egal, wohin man im Weltraum schaut, es ein bisschen übrig gebliebene Strahlung gibt. Sie bestimmten die Temperatur in diesem Spektrum und berechneten daraus, dass der Urknall vor 13,7 Milliarden Jahren stattgefunden haben muss. Und daher fiel uns der Zusammenhang ein, oder das ist, glaube ich, etwas, worüber es sich nachzudenken lohnt, dass Leben auf kosmischer Ebene existiert. Das Leben auf diesem Planeten entstand vor ungefähr 4 oder 3,5 bis 3,8 Milliarden Jahren. Während der Zeit, in der sich das Leben auf diesem Planeten entwickelte, in der Tat gerade seit den gemeinsamen Vorfahren von Pflanzen und Tieren, hat sich die Galaxie, in der wir uns befinden, etwa vier Mal um die eigene Achse gedreht. Das Leben selbst ist bemerkenswert aufgrund seiner Dauerhaftigkeit und der Tatsache, dass es wirklich auf kosmischer Ebene existiert. Lassen Sie uns daher einen kleinen Ausschnitt aus der Geschichte des Lebens betrachten. Hier sehen Sie den gemeinsamen Vorfahren von Würmern und Menschen. Auf dieser Folie zeige ich den Planeten Erde während eines so genannten „Schneeball Erde“-Ereignisses. Es gibt geologische Anzeichen in den Felsen, in der Erdkruste, für Vereisungen dieses Ausmaßes, bei der die Erde bis hinunter zum Äquator vollständig mit Eis bedeckt war. Und aus biologischer Sicht ist das, glaube ich, ein sehr interessantes Konzept, aufgrund der Frage, welche Auswirkungen diese Art von Ereignissen auf die gemeinsamen Vorfahren von Würmern und Menschen hätte. Hier haben wir also den gemeinsamen Vorfahren, ein anspruchsvoller, wirklich guter, kleiner Organismus mit allen möglichen Fähigkeiten. Es gibt Hox-Muster, es passieren alle möglichen faszinierenden Dinge da drinnen, wie RNA-Interferenz, funktioniert einfach prima. Aber er hat ein großes Problem: Auf der Erde selbst gibt es kein Land. Wo also soll der kleine Kerl leben? Entweder Hydrothermalquellen oder vielleicht kleine Risse im Eis, im Meer. Diese Art von Ereignis fand tatsächlich zwei Mal statt und beide Male kam es zu massivem Aussterben. Es gab also Hinweise auf ein Aussterben hier und ein Aussterben hier. Und dann, direkt nach dem Ereignis, gab es das biologische Pendant zum Urknall. Es gab die kambrische Artenexplosion. Und ich glaube nicht, dass es von biologischer Seite je eine adäquate Erklärung für die kambrische Explosion gab. Aber ich glaube aus geologischer Sicht stellen diese Eiszeitereignisse vielleicht eine sehr verlockende mögliche Erklärung dar, bei der…, was hier geschah, war letztlich, das Eis schmolz, die Erde wurde wieder bewohnbar, die Landmassen und die flachen Meere um das Land herum wurden bewohnbar und es gab diese wirklich erstaunliche Vervielfältigung des Lebens. Das rasche Auftauchen verschiedener Tiergruppen, darunter auch die Gruppe, aus der der Mensch hervorging, und die Gruppen, aus denen die Nematoden hervorgingen. Und wenn Sie weiter zurückgingen, befände sich der Ursprung der Pflanzen und Tiere in der Tat dort unten am unteren Rand der Seite. Aber Pflanzen und Tiere verfügen alle über RNAi und das ist die Sache, die, glaube ich, sogar meine Nachbarn begreifen. Wissen Sie, sogar die Leute, die keine Ahnung von Biologie haben, sie haben Angst, dass: Oh, wir sind doch nicht wirklich mit den Affen verwandt. Sie begreifen es tatsächlich. Und ich glaube, das liegt auch zum Teil an dem Präsidenten, den wir in den USA gehabt haben, dass die Leute das nun akzeptieren. Aber tatsächlich sind wir immer noch – wissen Sie, wie Nietzsche sagte, wir haben uns vom Wurm zum Menschen entwickelt, aber Vieles in uns ist eigentlich immer noch Wurm. Und ich glaube, das ist ein wirklich wichtiger Aspekt dessen, was ich als Biologe tun kann, um die Botschaft unserer gemeinsamen Abstammung rüberzubringen. Wir sind nicht nur mit Würmern verwandt, sondern jeder in diesem Saal ist eng, eng mit jedem anderen hier verwandt. Daher muss die Menschheit diese nationalistischen Schranken überwinden und anfangen, einander als Brüder und Schwestern zu betrachten. Nun, hier sehen Sie, womit sich die kleinen Würmer manchmal in ihrer richtigen Umgebung auseinandersetzen müssen. Es stellt sich heraus, dass es Hunderte von kleinen Pilzen gibt, die im Boden leben und sich von Würmern ernähren. Und sie haben sogar diese kleinen Fallen ersonnen, wie diese hier, in der Sie diese arme Nematode erkennen können, die hier eingefangen wurde. Ich werde Ihnen diesen kleinen Film zeigen, in dem Sie den tatsächlichen Vorgang sehen können. Dies sind bereits gefangene Würmer. Aber beobachten Sie diesen hier. Er schwimmt hier durch und sie schließt sich einfach um seinen Schwanz. Hier, sehen Sie sich auch diesen an, da kommt gerade ein anderer Wurm heran. Das sind die Gefahren, denen sie in der Umwelt natürlicherweise ausgesetzt sind. Diese Tiere begegnen allen möglichen Räubern. Und hier, sie hat sich gerade geschlossen. Ich weiß nicht genau, wie der Pilz die Nematode wahrnimmt. Aber er hat einen Auslösemechanismus, der auf Bewegung anspricht. Und wenn das geschieht, wird der Wurm gefangen. Und dann sendet der Pilz Hyphen in den Körper des Tieres und verdaut es von innen heraus, ein schreckliches Schicksal. Und dieses Drama wiederholt sich jeden Tag, während Sie zur Arbeit laufen. Es gibt 10 hoch 9 Würmer pro Kubikmeter Boden. Und wir nehmen nicht einmal wahr, dass sie jeden Tag ums Überleben kämpfen. Viele von Ihnen haben diesen Film gesehen. Tatsächlich habe ich mit mehreren Studenten aus China gesprochen, ich glaube, jeder in China hat jetzt meine Rede gesehen. Das also ist – sollte sie sein – meine lustige Folie. Ich muss warten, bis CBS News eine weitere Dokumentation oder so etwas über RNAi dreht, denn sie liefern solch großartiges Material. Das ist die 15-Sekunden-Erklärung von CBS News darüber, wie RNAi funktioniert. Schauen Sie genau hin. Hier ist die Doppelstrang-RNA. Hier sind die schadhaften Gene. Ich sehe, dass manche von Ihnen das noch nicht gesehen haben, ich habe das schon so oft gezeigt, ich liebe es einfach. Viele Leute wussten nicht, dass schadhafte Gene wie Käse-Flips aussehen. Und wahrscheinlich haben Sie auch nicht gewusst, dass RNA tatsächlich kauen kann. Aber das ist der Grund, warum Andrew Fire und ich wussten, dass wir diesen Mechanismus entschlüsseln mussten. Es war so ein spannendes Problem. Ich komme am Ende darauf zurück, es gibt ein paar Elemente hieraus, die tatsächlich stimmen. Und ich glaube, was tatsächlich interessant ist, ist, dass – auch wenn die Gene natürlich nicht wirklich wie Käse-Flips aussehen – dass RNA, RNAi die chromosomale Ausschaltung von DNA lenken kann. Wenn man Tetrahymena als Beispiel betrachtet, bei denen die RNA Chromatinänderungen steuert, die dann von Enzymen erkannt werden, die die Spaltung der DNA und die Eliminierung der DNA während der Entstehung des Makronukleus in Tetrahymena katalysieren. Die weitere Besonderheit ist natürlich, dass sie dies als aktiven Mechanismus dargelegt haben. Darauf komme ich gleich zurück. Das ist ein anderer Film von NOVA. In diesem Fall ein weiterer, netter kleiner Film. Er stammt von NOVA scienceNOW und der Film selbst dauert 15 Minuten, also ein ganzes Stück länger als der CBS-Ausschnitt. Es ist tatsächlich ein ziemlich netter Film, denn er vermittelt sogar Kindern das Konzept der RNA-Interferenz als Überwachungsmechanismus, der in diesem Fall virale Gene ausschalten kann. Und es gibt deutliche Hinweise, dass in vielen verschiedenen Organismen RNAi diese Funktion erfüllen kann. Aber selbst meine sieben Jahre alte Tochter glaubt nicht, dass es in jeder Zelle einen Polizisten gibt, daher glaube ich, dass dies eine sichere Analogie oder Metapher ist, wenn Sie so wollen. Die CBS-Metapher dagegen ist, glaube ich, ein bisschen pseudo-wissenschaftlich und es könnten Leute tatsächlich glauben, dass die RNA kauen kann, und das könnte schlecht sein. Aber diese mag ich sehr. Nun, hier ist ein weiterer Film, er ist von Nature. Dieser ist wie die Star-Wars-Version. Wir fliegen in den Kern der Zelle hier und jetzt fliegen wir die DNA entlang. Die DNA liegt hier ganz als supercoiled DNA vor. Und nun wird sie geöffnet und die Polymerase kommt hinzu und fängt an, eine Boten-RNA zu erstellen. Dies ist der Vorgang der Transkription. Dieser Film ist sehr hilfreich für Gymnasiasten oder Laien, die sich mit den Grundlagen der Biologie nicht auskennen. Das ist das Capping der Boten-RNA. Dies hier ist die RNA während des Spleißens. Jetzt wird sie aus dem Kern herausgebracht, das ist Polyadenylierung. Und die mRNA verlässt den Kern, hier kommt sie. Jetzt ist ein Wissenschaftler dabei, die RNA in die Zelle zu injizieren. Wenn Sie zuschauen, werden sie es sehen. Oh, hier ist das Ribosom, das mithilfe der Boten-RNA das Protein herstellt. Hier sehen Sie den Wissenschaftler, der die Doppelstrang-RNA injiziert, das sollte eine A-Helix sein, nicht das. Sie wird geschnitten, das ist Dicer, die schneidet wie... Jetzt, hier ist das Slicer-Enzym oder Argonaut und das verschwindet wieder, es kaut nicht, keine Angst. Und das Tolle daran ist, es kann – dieser Proteinkomplex findet mithilfe der Sequenzinformation hier die perfekten Übereinstimmungen. Und das geschieht katalytisch, er kann also weiter und weiter und weiter machen und Tausende von Transkripten stilllegen. Das ist wirklich bemerkenswert. Eine Möglichkeit, wie ich RNAi den nicht mit der Materie Vertrauten gerne beschreibe, ist: Stellen Sie sich vor, es gäbe das Internet, aber keine Möglichkeit darin zu suchen, keine Suchmaschinen, kein Google, keine Möglichkeit, etwas zu finden. Genau so stelle ich mir Ihr Genom vor, wenn es keinen Mechanismus wie RNAi hätte. RNAi verwendet eine kleine Suchsequenz, eine kleine Sequenz, genau wie das, was sie in das Fenster Ihres Google-Browsers eingeben würden, um Gene oder Sequenzen, mRNA oder sogar DNA in der Zelle zu finden und zu regulieren. Und das Wunderbare an diesem Mechanismus ist, er kann verwandte koordinieren – die Regulation verwandter Gene, die über mehrere Orte im Genom verteilt sind. Der Grund, warum wir RNAi untersuchen wollten, war der, dass wir feststellten, dass es bemerkenswert wirksam war. Und wirklich, wenn man dem Wurm RNA injiziert, war das Erste, was wir bemerkten, dass der Silencing-Effekt vererbt werden kann. Er konnte mittels einer Nachkommenschaft weitergegeben werden, die den Silencing-Effekt trug, und nach einer ganzen Generation Nachkommen mit diesem Effekt erzeugte. Und er konnte sogar über den Samen weitergegeben werden und Nachkommenschaft auch nach einer weiteren Folgegeneration mit diesem Effekt ausstatten. Und wenn man die entsprechenden Nachkommen selektiert, kann dieser Silencing-Effekt in C.elegans anscheinend endlos vererbt werden. Dies zu verstehen interessiert uns weiterhin sehr, denn diese langfristige Vererbung muss, aller Wahrscheinlichkeit nach, eine Art Veränderung auf Chromatinebene widerspiegeln. Es ist außerdem systemisch, da sich nämlich die injizierte RNA im gesamten Tier verbreiten kann. So kann man RNA zum Beispiel in den Darm einbringen und der Silencing-Effekt kann in der Keimbahn beobachtet werden. Es gibt also eine Möglichkeit, wie sich diese RNA-Moleküle von Zelle zu Zelle bewegen können. Und darüber müssen wir noch eine ganze Menge lernen. Als wir diese Phänomene bemerkten, stellten wir fest, dass es in dem Tier eine aktive Reaktion gab. Wie schon gesagt, die Filme, die ich gezeigt habe, enthalten alle einen aktiven Prozess. Entweder der Polizist oder die kauende RNA, es gibt eine Reaktion in dem Tier auf die Doppelstrang-RNA. Und da scheint es zum Beispiel einen Transportmechanismus zu geben, den Silencing-Effekt selbst und dann den Amplifikationsmechanismus oder den Vererbungsmechanismus. Und viele dieser Schritte verstehen wir noch nicht. Aber als wir anfingen, uns damit in C.elegans zu beschäftigen, gab es einen offensichtlichen Ansatz, mit dem man versuchen könnte, diese Mechanismen zu verstehen. Nämlich die Verwendung von Genetik. Der Erste, der sich mit der Genetik der RNA-Interferenz beschäftigte, war der Japaner Hiroaki Tabara in meinem Labor. und sie dann auf eine Bakterienkultur aufbrachte, die ein essenzielles Wurmgen exprimierte. Nun reagieren die Würmer so empfindlich auf Doppelstrang-RNA, dass sie sie mit dem Futter aufnehmen können und es in der Folge zur Stilllegung kommt. Eine Stilllegung, die so wirksam ist, dass man jedes Ei im Wildtyp des Wurms abtötet, wenn man ein essenzielles Wurmgen als Target nimmt. Man kann zum Beispiel ein für die Embryogenese erforderliches Gen ausschalten, indem man dieses Tier mit Bakterien füttert, die die Doppelstrang-RNA exprimierten. Sie fressen die Bakterien, sie schalten das Gen aus, keines der Eier wird reif. Also überlegte sich Hiroaki eine sehr einfache Untersuchung, bei der er einfach nach Tieren Ausschau hielt, die nach zwei Generationen lebensfähige Nachkommen hatten, und dadurch fand er jede Menge interessanter Gene, die am RNAi-Mechanismus beteiligt sind. Ich mache jetzt einen großen Sprung, denn ich weiß, ich habe heute nicht so viel Zeit, und erzähle Ihnen von dem Polizisten. Das Polizistengen war – zufällig – das erste Gen, das Hiroaki identifizierte. Er nannte es RNA Deficient Gen Nr. 1 oder RDE-1. Und es wird jetzt Argonaut genannt, nach dem ersten Pflanzengen aus dieser Familie, das als Entwicklungsdefekt in Pflanzen identifiziert wurde. Das Enzym wird hier in seiner Proteinstruktur, Kristallstruktur, die 2004 von Leemor Joshua-Tor und Ji-Joon Song hergestellt wurde, in grau dargestellt. Was Sie hier sehen, ist die Guide-RNA, die Silencing-RNA und die Messenger-RNA-Basenpaarung innerhalb dieser Einbuchtung des Enzyms. Der Vorgang der Basenpaarung, der hier stattfindet, drückt die mRNA gegen das katalytische Zentrum. Diese Domäne kodiert eine der RNase H verwandte Falte, die dann die mRNA abspaltet. Diese wird dann entsorgt und die siRNA darf weitermachen und weitere Gene stilllegen. Wir nennen diese short interfering RNA oder siRNA. Sie kann mehrere Reaktionen wie diese katalysieren. Das Lustige an diesem RNAi-Bereich ist, dass die Leute, die sich damit beschäftigen, offensichtlich zu viel fernsehen, insbesondere das Spätabendprogramm. Wahrscheinlich laufen spät abends, wenn sie vom Labor nach Hause kommen, nur diese Sendungen mit viel Werbung für so Dinge wie das Ginsu-Messer. Denn wir haben das vorgeschaltete Enzym Dicer genannt und dieser hier Slicer, es schneidet also in Würfel und Scheibchen. Und wenn Sie aus Amerika sind, dann haben Sie diese Werbung gesehen, in der man Ihnen dieses Messer verkauft, das auf alle erdenklichen Arten schneidet. Komisch an dieser Werbung ist aber, dass sie immer endet – wenn Sie gerade vorhaben, das Messer zu kaufen, sagen sie immer, dass dazu noch mehr gehört, dann versuchen sie, Ihnen die Steakmesser zu verkaufen, die dazu gehören. Und so in etwa ist das auch mit der RNAi. Immer, wenn Sie denken, dass es nicht noch toller werden kann, geschieht etwas sehr, sehr Interessantes und so in der Art war es. Wir klonten RDE-1 1999. Und für Andy und mich war das ein euphorischer Moment. Davor war die Tatsache, dass Doppelstrang-RNA Gensilencing auslösen könnte nur Phänomenologie. Sie war interessant, aber wir waren nicht sicher, ob es konserviert sein würde oder einfach nur eine Wurmgeschichte war oder ob andere Tiere dieselbe Art von Reaktion zeigen würden. Aber als wir RDE-1 klonten, fanden wir heraus, dass es ein stark konserviertes Gen mit vielen Homologen war. Und das ist einfach die Ahnentafel der RDE-1-verwandten Proteine in den verschiedenen Tieren. Das sind also Wurm-Homologe hier in rot, das sind andere Wurm-Homologe da drüben und weitere Wurm-Homologe dort. Nun, es stellte sich heraus, dass Menschen acht Kopien des RDE-1-Gens haben, hier sind vier und dort drüben sind vier menschliche Gene. Wenn Sie das hier betrachten, sehen Sie, dass die schwarze Gruppe der Argonautenproteine der älteste Zweig der Familie ist. Diese weisen sogar Pflanzen-Homologe in dieser Region dort drüben auf. Aber es gibt Tiere – beinahe alle vielzelligen Tiere haben zwei Familien: diese hier und diese hier, die wir als die Piwi-Familie der Argonautenproteine bezeichnen. Die gemeinsamen Vorfahren von Würmern und Menschen hatten also zumindest bereits zwei Argonautengene. Als wir RDE-1 klonten erhielten wir aufgrund der Genomsequenzen all diese anderen Informationen. Und das ist das Wunderbare und die Macht dieses genomischen Zeitalters, in dem wir uns befinden. Man klont ein Gen in einem Modellorganismus wie C.elegans und plötzlich hat man alle Gene in allen Organismen, die jemals sequenziert wurden. Aber dies erlaubte es uns, die Frage zu stellen: Was machten alle diese stark konservierten Gene? Und daher schaltete Alla Grishok diese beiden Gene im Labor aus und analysierte den Phänotyp. Um Ihnen einen Eindruck zu vermitteln, wie spannend ihre Entdeckung war, muss ich Ihnen ein bisschen was über die Arbeit von Victor Ambros erzählen. Das lin-4-Gen hat diese sehr interessante Eigenschaft, sich zu einer haarnadelartigen Struktur zu falten. Und Victor beschrieb zwei Formen des lin-4-Produkts. Eines ist eine aus 70 Nukleotiden bestehende Vorläuferform, das diese Haarnadelform annimmt, und das andere eine aus 21 Nukleotiden bestehende RNA. Das ist also ein natürlich vorkommendes Wurmgen, von dem man herausfand, dass es ein anderes Wurmgen, lin-14 genannt, reguliert, das von Gary Ruvkuns Gruppe analysiert wurde. Zusammen fanden Victors und Garys Gruppen…, zusammen fanden Sie heraus, dass lin-4 als negativer Regulator für ein Gen, lin-14, fungiert, das komplementäre Sequenzen in seiner 3’-UTR besitzt. Das war das erste Gen, das wir jetzt als microRNAs bezeichnen, dies war die erste microRNA. Und tatsächlich bekam Victor 1994 keine Anstellung in Harvard, obwohl er das Jahr zuvor gerade diese spannende Entdeckung gemacht hatte. Alle waren überrascht. Tatsache aber ist, dass es eine starke Voreingenommenheit gab, dass dies einfach eine ungewöhnliche Sache war, die bei Würmern vorkommt, aber mit dem Menschen vielleicht gar nichts zu tun hat. Aber zwischen damals und 2000 geschah etwas. Und zwischen 1993 und 2000 hatten wir genügend menschliche DNA sequenziert, dass man – Garys Gruppe suchte und fand ein perfektes Homolog des let-7 in der Sequenz des Humangenoms. Die gesamten 21 Nukleotide im Menschen sind also identisch mit den 21 Nukleotiden im Wurm. Und tatsächlich fanden sie heraus, dass jedes vielzellige Tier ein let-7-Gen besitzt. Und auch hier scheint let-7 Ziele durch Interaktion mit der 3’-UTR zu regulieren. Aber was uns noch fehlte…, trotz der Tatsache, dass diese ungefähr dieselbe Länge aufweisen wie siRNAs, blieb die Frage: Wie hängen die Synthesewege wirklich zusammen? Ist der Syntheseweg der RNAi mit dem der microRNA verwandt oder nicht? Und Allas Ergebnis ließ zum ersten Mal vermuten, dass die beiden Synthesewege verwandt sind. Und sie konnte zeigen, dass Mutationen in Dicer und Mutationen in diesen konservierten Argonauten zu Defekten in der Synthese führen. Hier ist der Wildtyp, aber wenn Dicer oder dieser Argonaut fehlen, gibt es einen Defekt in der Synthese dieses Vorläufers und es sammelt sich weniger von dieser reifen Form im Tier an. Der RNA-Interferenzmechanismus also, der an der Genstilllegung beteiligt ist, spielt eine konservierte Rolle bei der Genregulation, bei der der Wurm doppelsträngige RNA herstellt, indem er sie einfach durch reguläre Gene kodiert, die dann in diese siRNAs umgewandelt werden und fortfahren können, ihre Ziele zu regulieren. Das war sehr spannend. Und jetzt wird es noch spannender, weil sich herausstellt, dass diese microRNAs eine wichtige, entwicklungsbezogene Rolle spielen, darunter gibt es auch einige sehr wichtige Zusammenhänge mit der Krebsbiologie beim Menschen, darunter auch Zusammenhänge, bei denen die microRNAs an der Verhinderung der Zellteilung und dem Unterdrücken von Krebs beteiligt sind, also eine Art tumorunterdrückende Rolle für die microRNA-Gene, oder es sind „chimäre“ Gene, Gene, die die Zellteilung fördern. Dies ist eine Abbildung aus dem Labor von Carlo Croce. Es stellt sich heraus, dass dies verschiedene Patientenproben sind und dies ist ein Satz von etwa 100 microRNAs des Menschen. Hier schauen sie sich das Genexpressionsprofil in verschiedenen Patientenproben auf dieser Achse an. Und sie können erkennen, dass bestimmte microRNAs in manchen Tumoren hoch reguliert und in anderen runter reguliert sind. Wie sich herausstellt, ist es durch Betrachtung dieser Profile tatsächlich möglich, Voraussagen darüber zu machen, wie ein bestimmter Tumor auf eine Behandlung ansprechen wird. Außerdem erweisen sich einige der microRNAs, bei denen man erkannt hat, dass sie mit einem onkogenen Zustand korrelieren, als potenzielle Ziele, um das Tumorwachstum zu unterdrücken. Und hier gibt es noch viel mehr. Und ich glaube, daran arbeitet das Labor noch. Ich zeige Ihnen ein paar Folien der Arbeit von Wai Fong, einem neuen Postdoc im Labor. Was Sie hier sehen ist ein Gel, und dies sind tRNAs. Wir sehen RNAs. Und wenn Sie ganz nach unten, auf den Grund des Gels schauen, dort gibt es RNA-Spezies, was alle bisher einfach für Abfall hielten. Aber wie sich herausstellt, ist das genau die Stelle, an die die microRNAs wandern, ganz hier unten, hier gibt es eine Bande, die bei diesen Mutanten fehlte, wie Wai Fong bemerkte. Das sind die RNAi-Mangelmutanten. Das hier ist Dicer, die für den Syntheseweg der microRNA erforderlich ist. Und Sie erkennen, dass diese Bande hier vorhanden ist in Dicer…, sie ist im Wildtyp vorhanden, aber sie fehlt in diesen Mutanten hier. Das sind alles Mutationen eines Gens namens DRH-3, Dicer-Related Helikase 3. Und es stellt sich heraus, dass diese siRNAs triphosphoryliert sind, wohingegen Dicer, wenn sie diese RNA schneidet, aufgrund ihrer enzymatischen Wirkung ein Monophosphat am Ende erzeugt. Triphosphate würden von einer Polymerase hinterlassen und wir glauben, dass diese siRNAs die Produkte einer Polymerase sind. Diese Spezies hier, die microRNAs sind da, aber es gibt auch eine andere Spezies kleiner RNA mit irgendeiner 3'-Modifikation und wir sind noch dabei, diese zu analysieren. Hier sehen Sie ein Beispiel dafür, das sind was wir natürliche endogene kleine RNAs nennen. Sie unterscheiden sich von microRNAs dahingehend, dass sie nicht durch eine haarnadelartige Struktur codiert sind. Das ist ein Gen namens K02. Im Wildtyp ist die mRNA für dieses Gen in geringer Konzentration vorhanden und es gibt eine Menge siRNA in Tieren des Wildtyps. In den von Wai Fong analysierten Mutanten wird die Messenger-RNA jetzt in höherer Konzentration exprimiert und die siRNA ist verschwunden. Das sind also natürlich vorkommende Silencing-RNAs, die auf eines der wurmeigenen Gene abzielen, und wir wissen nicht warum. Also hat Wai Fong eine Strategie entwickelt, um diese zu sequenzieren. Das ist nur ein Beispiel dafür, aus Wai Fongs Sequenzierungsdaten, wie eine Karte dieser siRNAs aussieht. Wir beginnen gerade damit, mit einem sehr hohen Durchsatz zu sequenzieren. Kleine RNAs aus dem gesamten Genom des Wurms, um zu versuchen herauszufinden, auf welche Gene diese natürlichen Silencing-RNAs abzielen. Sie sehen, dass dieses bestimmte Gen mit diesem langen Namen hier wahrscheinlich Hunderte – oder Tausende siRNAs in jeder Zelle hat, die auf das ganze Gen abzielen. Und wir wissen nicht, wie diese generiert werden oder warum es sie gibt und wie sie im Tier funktionieren. Wir wissen jedoch, dass aus den rund 6.000 siRNAs dieses Typs, die wir analysiert haben, wir bereits 3.000 verschiedene Gene ausmachen konnten. In den Proben, die wir bisher analysiert haben, bilden die meisten Gene nur für wenige siRNAs ein Ziel. Daher glauben wir, dass sich dies als sehr wichtiger Regulationsmechanismus für die Gene im Wurm erweisen wird. Ist das also eine weitere Wurmsache oder nicht? Nun, das ist eine Maus und dies basiert – wir haben dieses Experiment gerade selbst in unserem Labor durchgeführt. Aber letztes Jahr gab es drei oder vier Artikel über etwas, das als piRNAs bezeichnet wird. Diese gibt es zuhauf in der Maus und die piRNAs sind eigentlich siRNAs mit 30 Nukleotiden, sie sind also länger als 21. Sie sind 30 Nukleotide lang. Sie kommen so häufig vor, dass sie ein leuchtendes Signal in mit Ethydiumbromid gefärbtem Gel bilden. Es ist erstaunlich, dass niemand sie je zuvor bemerkt hat. Wie sich herausstellt, interagieren sie jedoch mit der Piwi-Klasse, Argonauten. Darum werden sie piRNAs genannt. Und ihre Funktionen werden noch erforscht. Sie scheinen eine Rolle bei der Transposon-Suppression zu spielen, aber sie können auch noch eine grundlegendere Rolle bei der Genregulation spielen. Sie können sie wahrscheinlich kaum erkennen, aber das ist die Bande, die Wai Fong analysiert hat. Und es gibt Banden hier in der Maus, die eine ähnliche Intensität aufweisen. Es gibt also noch jede Menge zu erforschen darüber, wie diese kleinen RNAs die Entwicklung regulieren. Und ich komme jetzt am Ende meines Vortrags zurück auf dieses Konzept, wie die RNAs mit der DNA interagieren. Hier ist die Doppelstrang-DNA. Der Grund, warum ich diese Folie zeige, ist, mit der Entdeckung der DNA wurden die Molekularbiologen, glaube ich, ein wenig übermütig. Wir dachten, wir hätten herausgefunden, wie das Leben funktioniert, wir dachten, wir würden verstehen, wie Informationen in uns selbst gespeichert werden. Die DNA erklärt eine Menge, sie kann die mendelsche Aufteilung von Merkmalen erklären. Und sie kann erklären, wie genetisches Material repliziert wird und wie Mutationen entstehen können. Sie ist also ein sehr mächtiges Paradebeispiel, aber ich glaube, sie hat uns zu zuversichtlich gemacht. Und ich glaube, RNAi bringt uns ein bisschen zurück auf den Boden der Tatsachen. DNA sieht in der Zelle gar nicht so aus wie hier, sie ist eingehüllt und in diese Strukturen höherer Ordnung gefaltet. Das ist eine 30-nm-Faser, dies sind die Nukleosome und hier sehen Sie ein Kristallstrukturmodell, das die Histonproteine innen drinnen und die darum gewickelte DNA zeigt. Das hier ist eine andere Abbildung, in der die DNA ungefähr zwei Mal herumgeht. Und diese kleinen Schwänze ragen aus den Histonen hervor, und diese Schwänze, wie Sie vielleicht wissen, bilden die Ziele für viele Arten der Regulation. Sie können eine Rolle bei der Aktivierung oder Unterdrückung der Transkription der um diese Nukleosomen gewickelten DNA spielen. Und diese Information, die aus Proteinen stammt, die diese Schwänze modifizieren, ist für mich sehr interessant, denn es sieht so aus, als könnten siRNAs diese Modifikationen steuern, indem Sie remodellierende Komplexe und Proteine zum Chromatin bringen, die diese Änderungen am Histonschwanz erkennen. Aufgrund dieser Art der Interaktion zwischen dem Chromatin und der RNA kann man sich die DNA mehr wie die Hardware eines Computers vorstellen. Und die Proteine und die RNA, die regulieren, die mit diesen Histonschwänzen interagieren, sind wie die Software. Die Analogie, auf die ich gerne hinweise, ist die, dass wir uns für differenziert halten, richtig? Wir alle haben dasselbe Genom in jeder Zelle, aber Zellen verhalten sich unterschiedlich. Nun, warum verhalten sie sich unterschiedlich? Sie verhalten sich unterschiedlich, weil die DNA…, verschiedene Gene sind angeschaltet und andere Gene sind abgeschaltet und sie sind sehr stabil an- und abgeschaltet. Und das ist der Grund warum wir stabil differenzierte Lebewesen sind. Etwas, woran ich im Moment sehr interessiert bin, ist ein Konzept, für das wir gerade überlegen, wie es ich im Labor testen lässt, nämlich dass die Keimbahn selbst differenzieren kann, und dass dieser Differenzierungsprozess es der Keimbahn gestattet, sich ohne Änderung der zugrundeliegenden Nukleotidsequenz zu entwickeln. Man könnte sich also vererbbare Änderungen auf dieser Ebene vorstellen, die durch die Interaktionen mit siRNAs über viele Generationen beibehalten werden. Wenn Sie zurückschauen auf die Geschichte, wie man vor der DNA über die Evolution gedacht hat Leider haben wir alle ein zu großes Faible für Jargon, daher war sein Wort für Gene Biophoren. Aber er stellte sich Gene vor, die viele, viele Male pro Zellteilung repliziert werden konnten, nicht nur ein Mal. Und sie konnten ungleichmäßig auf die Zellen aufgeteilt werden. Er dachte, so ließen sich Differenzierung und Entwicklung erklären. Und er brachte dieses Konzept der Biophoren auf, das nach Mendels Entdeckungen verworfen wurde. Wenn Sie aber Weismanns Theorie lesen und überall dort, wo er das Wort Biophore verwendete, Biophore durch siRNA ersetzen, funktioniert seine Theorie wunderbar. Daher glaube ich, wir müssen einen Schritt zurückgehen und erneut über Evolution und Entwicklung nachdenken. Darwin ging noch weiter als Weismann und brachte das Wort „Gemmules“ in Umlauf. Und diese waren in der Lage, die somatischen Zellen zu verlassen und in die Keimbahn einzudringen und dort erbliche Änderungen hervorzurufen, die… ich sehe Hans aufstehen, das ist ein schlechtes Zeichen. Daher fasse ich mich kurz. Aber RNA könnte sein, RNAi, vielleicht sollten wir diese in RNA-Information umbenennen, denn die RNA kann die Regulation der DNA steuern. Nun, hier ist Hans. Ich bitte ihn, mich jederzeit anzurufen. Er ist übrigens derjenige, der den Anruf macht. Also seien Sie nett zu ihm. Hier sind Andy und seine Frau Rachel. Das ist die Klasse von 2006, das sind John Mather und George Smoot dort drüben, Orhan Pamuk, Rodger Kornberg, Ed Phelps, Muhammad Yunus und ein Vertreter der Grameen Bank. Das ist nur ein Familienfoto mit meiner Tochter Melissa und Victoria, die auch hier auf der Veranstaltung sind. Hier ist meine Frau, und sie erhält ein paar Ratschläge über Ökonomie auf dem Bankett. Und hier gibt sie selbst ein paar Ratschläge. Während des Banketts nannte Ed meine Frau eine Kommunistin – sie wuchs in Ungarn auf. Und hier ist George, der mir den Urknall erklärt. Und Sie erkennen, dass ich diesen glasigen Ausdruck im Gesicht habe, denn, wissen Sie, ich denke, das ist eine nette Geschichte, aber glauben Sie mir, es gibt in dieser Geschichte noch eine Menge Geheimnisse. Und hier ist Victoria, die ein paar Goldmedaillen einsammelt, das sind sehr nette Goldmedaillen, denn da drinnen ist Schokolade. Und hier ist Vickie, wie sie mit mir tanzt, es war eine tolle Zeit dort. Das ist die Gefahr einer dieser Preise, Sie können sehen, wie ich für einen Vorsitz am Nobelmuseum unterzeichne, und Sie können erkennen, was mit meinem Körper geschehen ist, mein Kopf ist riesig und mein Körper ist sehr klein ausgefallen. Das ist also eine der Gefahren. Aber, und ich sage Ihnen, es gibt ein echtes Gegenmittel dagegen, und ich ende einfach mit dieser Folie, das ist Tara Bean, 1998, das ist ihr Bild. Bei ihr wurde ein Gehirntumor im dritten Stadium festgestellt aufgrund der Sehstörungen, die sie entwickelte. Sie wuchs in meiner Heimatstadt auf, wir kennen ihre Familie, und sie wurde in dem Krankenhaus untersucht, in dem ich arbeite. Leider verlor sie ihren Kampf gegen den Krebs. Seit ihrem Tod haben wir eine Menge über die grundlegenden Mechanismen von Krebs gelernt. Wir müssen noch sehr viel mehr lernen. Wir arbeiten an einer Menge äußerst spannender Themen und es vergeht nicht ein Tag, sogar hier auf dieser Veranstaltung, an dem ich nicht irgendeine E-Mail von jemandem bekomme, der sich um einen kranken Angehörigen sorgt, jemand, der glaubt, dass ihm RNAi vielleicht helfen könnte. Und leider lautet die Antwort immer noch, dass solche Heilbehandlungen vielleicht noch Jahre brauchen und sehr schwierig sind. Daher müssen wir zurück an die Arbeit, sobald die Veranstaltung vorbei ist, jeder muss zurück an die Arbeit und versuchen, neue Wege der Heilbehandlung zu finden. Und ich glaube, ich mache hier Schluss. Tut mir leid, ich brauche immer länger. HANS JÖRNVALL. Vielen Dank, Craig, das war ein wunderbarer Vortrag und wir lernen auch noch für die Zukunft. Ich fühlte mich wie ein schlechter Junge, hier hochzukommen und Dich zu unterbrechen. Aber da wir gesagt haben, wir wollten einige Fragen zulassen und andere Vorträge verlängern, dachte ich, das sollten wir auch tun. So, dieser Vortrag ist jetzt für Fragen geöffnet. Ich habe Ihre Hand zuerst gesehen. Mir wurde ein Mikrophon versprochen. Ja, sie hat eines. FRAGE. Ich heiße … (inaudible 50:05). Ich bin ein Arzt aus Pakistan. Sie sagten, dass RNAi die chromosomale Eliminierung von DNA bewirken kann. Ist es daher eine mögliche Therapie, Bakterien oder Viren, die doppelsträngige RNA exprimieren, zu injizieren, um die an der Pathophysiologie von Zellen in Tumoren oder Krebs beim Menschen oder bei Mausmodellen beteiligten Gene stillzulegen? CRAIG MELLO. Nun, potenziell. Aber diese Silencing-Versuche, die beim Menschen jetzt gerade durchgeführt werden, zielen nicht darauf ab, die dem Zielgen entsprechende DNA zu eliminieren. Man kann mithilfe der RNAi ein teilweises Abschalten der Genexpression eines Gens in einer menschlichen Zelle erreichen. Und das wird gerade als therapeutische Strategie von vielen verschiedenen Firmen auf der Welt entwickelt. Und es werden sogar gerade einige klinische Studien am Menschen für mehrere verschiedene Indikationen durchgeführt. Es sieht daher so aus, als könne das ein zukunftsfähiger Ansatz sein, aber ob man je in der Lage sein wird, tatsächlich die Eliminierung eines Gens bei einem Patienten zu bewirken, weiß ich nicht, und in vielen Fällen möchte man das sicher auch gar nicht. Das ist also wahrscheinlich nicht möglich. Fragen? HANS JÖRNVALL. Ich habe eine andere Hand ganz in der Nähe gesehen und eine Hand dort drüben. FRAGE. Das ist wirklich erstaunlich und ich bin wirklich sensibilisiert. Aber zu Beginn Ihres Vortrags haben Sie auf die Bedeutung der Politik in der Wissenschaft hingewiesen und ich möchte Ihnen da vollkommen zustimmen. Ich habe auch festgestellt, dass es ein langer Weg bis zu dem war, was Sie heute vorgestellt haben. Und ich würde gerne von Ihnen hören, wie viel das kostet, denn ich interessiere mich sehr für die wirtschaftlichen Aspekte und dies alles muss ein Vermögen gekostet haben. Und ich weiß, dass die Bush-Regierung die Afrika-Forschung stark eingeschränkt hat, weil sie fand, wir sollten keine Geld für die Forschung verschwenden, sondern uns um die Armut kümmern. Und einige von uns haben das Gefühl, dass Forschung ein anderer Weg aus der Armut ist. Aus Ihrer Erfahrung, was würden Sie zu dieser Bemerkung sagen? CRAIG MELLO. Nun, ich bin nicht sicher, ob ich Ihre Frage ganz verstanden habe. Aber lassen Sie mich einfach sagen, dass die Arzneimittel, die Sie aus RNAi gewinnen können, unter Verwendung von RNAi als Arzneimittel, so teuer und so stark auf den Einzelnen zugeschnitten sein werden, dass sie eine Menge Potenzial haben. Aber ich bezweifle sehr, dass sie zu mehr als einem paar Prozent der Weltbevölkerung durchdringen werden. Die leicht zu liefernden Arzneimittel sind Pillen. Und wenn man oral zu verabreichende kleine Moleküle entwickeln kann, dann kann man die Arznei wirklich kostengünstig in den Patienten bringen. RNAi dient dazu, neue Synthesewege erkennen zu helfen usw., um neue behandelbare Ziele zu finden. Aber RNAi als Arzneimittel wird sehr schwer als Therapie in die Dritte Welt zu bringen sein, denn sie muss injiziert werden. Das ist also ein wenig schwieriger. Ich glaube, das ist tatsächlich eines der Dinge, die wir lösen müssen. Wir können eine Menge Zeit damit verbringen, Krankheiten zu heilen, die nie zuvor geheilt wurden. Aber in großen Teilen der Welt sind die Krankheiten – da geht es einfach um Mangelernährung und Durchfall, wodurch viele Menschen sterben, oder Malaria oder eine andere bekannte Krankheit, die behandelbar wäre. Und die Medikamente fehlen dort aufgrund von politischer Instabilität oder Infrastrukturproblemen. Das sind die Dinge, für die, wie ich glaube, eine interdisziplinäre Anstrengung erforderlich ist, um zu versuchen sie zu lösen. Medizin…, wir können diesen Weg hin zu immer komplexerer, immer spezialisierterer Medizin weitergehen, ohne die Menschheit soweit voranzubringen wie wir könnten, wenn wir etwas Zeit investieren würden, um zu helfen,.. Ich glaube, das beantwortet in etwa Ihre Frage. HANS JÖRNVALL. Vielen Dank. Und dann waren Sie dran, ja. FRAGE. Hi, ich bin Shawn aus … (inaudible 54:16) UK. Ich habe eine Frage zum Aspekt der Systembiologie. Ich habe viel über dieses Problem nachgedacht, wie die Zelle in Bezeug auf die Systembiologie entscheidet, welchen Teil der kleinen RNA man nehmen sollte. Bei einer viralen Antwort etwa gibt es mRNAs oder saRNA-Mechanismen. In Bezug auf das Wandzellkonzept, wie würde die Zelle den Mechanismus für die RNA-Abwehr auswählen? CRAIG MELLO. Ich habe keine Ahnung. Das ist eine sehr interessante Frage. Aber wissen Sie, die Regulation dieser Mechanismen ist etwas, das einfach noch nicht vollständig erforscht wurde. Wir wissen nicht, wie microRNAs wirklich funktionieren und wie sie ihre Ziele regulieren. Wir wissen nicht einmal, wie sie – vermutlich, weil sie verschiedene Methoden der Stilllegung haben – wissen wir nicht, welche sie – wie sie auswählen, wie, um das Gen entweder zu spalten oder um es einfach abzuschalten oder um es auf einen Lagerplatz zu senden. Es gibt eine Menge Möglichkeiten, wissen Sie. Eines der spannenden Dinge in Bezug auf RNAi jedoch betrifft die eukaryotische Zelle. Ich glaube, sie bildet einen Mechanismus, um Transkription und Translation zu verbinden, sodass die Zelle, während sie eine Botschaft transkribiert, diese zum Lagern und zur späteren Verwendung markieren kann. Ein Konzept, dass es der Zelle erlauben würde, eine zur späteren Verwendung gekennzeichnete Botschaft trotz vorhandener Kernmembran zu exportieren. Und das ist ein wirklich interessantes Konzept. Es gibt also jede Menge interessanter Möglichkeiten zur Regulation. Ich glaube, es wird Jahre dauern, die alle im Einzelnen zu erforschen. HANS JÖRNVALL. Weitere Fragen? Ich habe Ihre Hand gesehen und dann Ihre Hand. CRAIG MELLO. Ich glaube, Hans kann nicht weiter sehen als bis zu… HANS JÖRNVALL. Na danke. Ich habe nicht Deinen Weitblick. FRAGE. Ich heiße Matthew Albert und bin von INSERM in Frankreich. Ich interessiere mich für doppelsträngige RNA und Einzelstrang-RNA mit 5'-Triphosphaten. Sie sind als Adjuvantien in der Immunologie bekannt und senden ihre Signale durch Pattern-Recognition-Moleküle wie Toll-like Rezeptoren und interzelluläre Helikasen. Ich war neugierig zu erfahren, ob Würmer ähnliche Mechanismen für die Aktivierung des Immunsystems besitzen. Und wie Sie sich vorstellen, wie auf verschiedene Weise zwischen Zell- und Virus-RNA unterschieden werden kann, um anomale Immunreaktionen zu verhindern. Das ist eine großartige Frage. Und wirklich ist die Dicer-Related-Helikase, die ich genannt hatte, ein Homolog von RIG-I, MDA-5 und LGP-2, die alle zur Dicer-Familie der Helikasen gehören. Das ist unsere Bezeichnung für sie, Dicer-Related-Helikasen. Das Faszinierende daran aber ist, dass diese alle an der angeborenen Immunantwort des Menschen, der anti-viralen Antwort, beteiligt sind. Und kürzlich wurde die Dicer-Related-Helikase, menschliche Versionen davon, mit der Erkennung von triphosphorylierter, nicht siRNAs, sondern der viralen Produkte, die triphosphoryliert sind, in Zusammenhang gebracht. Es gibt also wirklich eine Homologie zwischen den anti-viralen Mechanismen beim Menschen und den RNAi-Mechanismen beim Wurm. Die Würmer haben sich eine sehr wirksame sequenzspezifische Antwort erhalten. Der Mensch hat diese Antwort entweder verloren oder sie ist sehr viel weniger wichtig oder es gibt sie nur bei bestimmten Zelltypen, wir wissen nicht, was davon zutrifft. Wenn die menschliche Zelle einen viralen Vorgang erkennt, begeht sie Selbstmord, und ein- und dieselben Rezeptoren sind sowohl an der Erkennung der viralen Replikationsprodukte als auch an der Aktivierung eines apoptotischen Signalwegs beteiligt. Das ist ein sehr effizienter Weg, einen Virus loszuwerden, wenn man über 10 Billionen Zellen verfügt, aber wenn man nur 1.000 hat, bringt man die Zellen besser nicht um. Daher sind die Würmer vielleicht sehr gut in Bezug auf den sequenzspezifischen Aspekt von antiviral oder Stilllegen. Die Homologie und die Ähnlichkeiten zwischen diesen Mechanismen sind faszinierend, und tatsächlich stellt sich heraus, dass LGP-2 der drei menschlichen Mitglieder dieser Familie mit Dicer und einem anderen Protein interagiert, das wir beim Wurm gefunden und pure 1 genannt haben. Es ist eine Phosphatase, die Triphosphate erkennt und zwei davon entfernt, um ein Monophosphat zu erzeugen. Es gibt einen Komplex beim Menschen, der anscheinend aus zumindest diesen drei Proteinen besteht. Daher glauben wir, dass die menschliche Zelle diesen Mechanismus auch haben könnte. Und wir sind noch dabei, herauszufinden, wie der Mensch das mit der sequenzspezifischen Stilllegung anstellt. HANS JÖRNVALL. Dann habe ich es Ihnen versprochen. Und danach gehen wir weiter weg. FRAGE. Ich heiße…(inaudible 59:16). Ich komme aus Indien. Was ich wissen wollte ist, ob Sie RNA-Interferenz bei der Heilung von Krebs oder dem Kampf gegen den Krebs verwenden. Gibt es einen Mechanismus oder gibt es eine Methode, RNA zellspezifisch zu machen, um die Mitose bei Krebszellen zu unterdrücken? Gibt es eine Möglichkeit, nur die Zellen dort drinnen anzusteuern? Denn der Mechanismus der Mitose ist bei normalen Zellen und bei Krebszellen der gleiche. CRAIG MELLO. Richtig, Krebs ist eine große Herausforderung für ein RNAi-Therapeutikum. Und ein sehr wichtiger Aspekt wäre offensichtlich, es spezifisch in den Tumor einzubringen, denn wenn man versucht, einzugreifen, sagen wir bei der Mitose, würde man die gesunden Zellen ebenfalls töten. Es ist das gleiche Problem wie bei vielen Krebstherapien. Das ist also auch ein Problem, das noch nicht gelöst wurde. Aber eines, an dem Leute arbeiten. Es gibt mögliche Lösungen, aber ich kann Ihnen im Moment keine nennen. HANS JÖRNVALL. Könnten wir das Mikrofon vielleicht hier rüber bekommen? FRAGE. Würmer reagieren außerordentlich sensibel auf RNAi. Ich meine, sie nehmen sie sogar über ihre Nahrung auf. Welche evolutionären Vorteile hat die Entwicklung einer solchen Sensitivität Ihrer Meinung nach? Ich meine, wenn man bedenkt, dass es diese bei anderen Organismen nicht gibt. CRAIG MELLO. Warum sind sie so empfindlich, dass sie sie sogar über ihr Nahrung übertragen können? Das ist sehr interessant. Wissen Sie, diese Würmer sind Hermaphroditen, sie sind auch zur Befruchtung in der Lage, Fremdbefruchtung durch männliche Tiere. Aber sie kolonisieren Nahrung im Boden, sehr häufig findet ein einzelner Wurm die Nahrung und muss dann die Nahrungsquelle ohne einen Partner besiedeln. Daher befruchten sie sich selbst und erzeugen Tausende und Millionen von Nachkommen. Wenn Sie anfangen zu hungern, machen sie etwas sehr Interessantes: Diese Mütter sind sehr altruistisch, sie behalten ihre Eier auch, wenn sie hungern und sie gestatten den Eiern, in ihnen drinnen zu reifen. Auf diese Art reifen die Nachkommen in der Gegenwart einer reichen Nahrungsquelle heran, der Mutter. Und dann fressen sie die Mutter, sie erreichen ein Alter, in dem sie alt genug sind, zu einer Dauer-Larve zu werden, einer sehr resistenten Form, und sie können im Boden davon wandern, um neue Nahrungsquellen zu finden. Das interessante daran ist, dass, wenn ein Tier hungert und seinen Nachkommen gestattet, es selbst zu fressen…, es hat vielleicht zu Lebzeiten Immunität gegen Viren entwickelt, die dann über die Nahrungsaufnahme an die Nachkommen weitergegeben werden kann. Das ist eine Erklärung, die mir jetzt einfach so einfällt, so eine Art umfassende Idee. Aber ich glaube, es ist möglich, dass – aufgrund der Art, wie sie leben, möchten sie bestimmt in der Lage sein, diese Silencing-Aktivitäten an ihre Nachkommen weiterzugeben. Ein etwas peinlicher Aspekt des Ganzen ist, dass Forscher, die sich mit C.elegans beschäftigen noch nicht einen einzigen Virus aus ihnen isoliert haben. Daher kennen wir keinen Virus, den wir verwenden könnten, um dieses Modell, na sagen wir, zu testen. Es gibt keine viralen, existierenden viralen Beispiele von Nematoden. Vielleicht sind sie einfach so gut darin, sie auszuschalten. Wahrscheinlich ist es einfach keine stabile Interaktion im Labor. Daher verlieren wir sie sehr schnell. HANS JÖRNVALL. Vielen Dank. Ich dachte gerade, ich sollte sagen, dass wir hier aufhören. Aber noch eine letzte Frage für Sie. CRAIG MELLO. Sie können sie rufen. Ich werde sie hören. FRAGE. Sie betrifft die Verwendung von siRNA und Therapie: Gibt es kein Problem zwischen der hohen Spezifizität von siRNA und den Abweichungen in den Allelen bei defekten Genen? Zum Beispiel bei der Verwendung von shRNA zur Bekämpfung von AIDS, es gibt eine Menge HIV-Mutanten. So, wie könnten Sie sich das vorstellen? CRAIG MELLO. Nun, man könnte zelluläre Gene als Target verwenden, die weniger zu Mutationen neigen, das ist eine Strategie. Und natürlich könnte man eine siRNA konstruieren, die an der Region des Genoms ansetzt, die aus irgendwelchen Gründen nicht sehr häufig mutiert. Und diese Strategien werden versucht. Ich glaube, es läuft gerade eine HIV-Studie, bei der Silencing-RNA mittels Gentherapie eingebracht wird. In den USA ist das entweder schon genehmigt oder wird es in Kürze werden. Man versucht es also mit diesem Ansatz sogar bei HIV. Aber normalerweise gibt es nicht so viele Abweichungen bei den Allelen, daher kann man sich eine Region aussuchen. Jedenfalls nicht bei normalen Genen. Bei viralen Genen – ja, da schon. Aber bei den normalen zellulären Genen gibt es weniger Variabilität. Daher kann man eine siRNA wählen, die auf eine konservierte Region abzielt. Interessanterweise kann man, im Falle einer dominanten Mutation zum Beispiel, die zu einem veränderten Phänotyp führt, seine siRNA sogar so konstruieren, dass sie nur auf das mutierte Allel abzielt. Und das geschieht mit einiger Selektivität, man kann spezifisch das mutierte Allel ausschalten, indem man die siRNA entsprechend konstruiert. So dass sie das Wildtyp-Allel nicht spaltet, nur das mutierte. Es gibt also noch jede Menge Möglichkeiten, RNAi als Therapeutikum einzusetzen. HANS JÖRNVALL. Vielen Dank.


Argonaute proteins interact with small RNAs to mediate gene silencing. C. elegans contains 27 Argonaute homologs, raising the question of what roles these genes play in RNAi and related gene-silencing pathways. Through our collaborator, Dr. Shohei Mitani, we have obtained a set of 30 deletion alleles representing all of the previously uncharacterized Argonaute genes. Analysis of single- and multiple-Argonaute mutant strains reveals essential functions in several pathways including: (i) chromosome segregation, (ii) fertility, and (iii) at least two separate steps in the RNAi pathway. We show that RDE-1 interacts with trigger-derived sense and antisense RNAs to initiate RNAi, while several other Argonaute proteins interact with amplified antisense siRNAs to mediate downstream silencing. Overexpression of downstream Argonautes enhances silencing, suggesting that these proteins are limiting for RNAi.

These downstream Argonautes also function in endogenous RNAi (endo-RNAi) pathways of unknown function. A distinct Argonaute, ERGO-1, appears to function in a manner analogous to RDE-1 at an upstream step in the endo-RNAi pathway. The ERGO-1 and RDE-1 mediated pathways appear to compete for the downstream secondary Argonautes which lack key residues required for mRNA cleavage. Thus our findings support a two-step model for RNAi, in which Argonaute proteins function sequentially, and downstream silencing is mediated by a set of Argonautes unlikely to harbor catalytic-slicer activity.