So I'd like to tell you this morning about the two different stories.
One is our recent molecules that we have developed against cancer and particularly they are called
activatable cell penetrating peptides, ACPP's.
The primary use, the first use is for florescence imaging of matrix metalloproteinase activities
or actually they can be used for targeting chemotherapy and radiotherapy.
But I don't have time to discuss that sort of work.
The people in my lab and our outside collaborators are listed here, but I have a conflict of interest disclosure.
A new company, Avelas Biosciences, has been started to commercialize these synthetic probes,
and I and some of the members of my lab, our advisors, collaborators, have some stock in the company.
So you have to bear that conflict of interest in mind.
Also, it opens the possibility that I will discuss at the last slide of this half about the long term prospects.
Then the other story is molecules that nature uses to store memories in our brain
and this is the neurobiology to perineuronal net.
The people involved are Varda Lev-Ram, Sakina Palida with some help from mass spectrometer colleagues.
This is a very different story.
Bunch of more basic research instead of applied research.
They're very seemingly very different, but at the end I will try to show you that there is a, surprising similarity,
certain surprising similarities as well as the contrast.
First, I have to explain why I got the Nobel Prize and why I don't work on these subjects any more.
Some of the fluorescent proteins that were available in 2004, in this famous one slide summary,
encode pretty colours across the rainbow.
Each of these tubes contain the fluorescent protein and each fluorescent protein is encoded by DNA.
Non-toxic, synthesizable by any aerobic organism.
And by the way if you’re a chemist, I, you know, got a chemistry prize, you have to mention that they are synthesized
with 230 condensations of cyclization and whatever oxidation, in 100% yield, in aqueous medium, and only a little bit
of hydrogen peroxide as a byproduct.
That just shows how good a chemist nature is compared to us as ordinary chemists.
But, fluorescent proteins have advantages and limitations.
The good side is that fluorescent proteins have had a major impact on basic biomedical science.
Most important proteins and key biochemical steps.
Eventually we were able to image them in live cells or model organisms of yeast, worms, flies, mice, etc.
Other people have gone on to, many super-resolution Nobel Prizes,
derived some benefit from our fluorescent proteins, etc.
But, I felt that they were unfortunately weak, fluorescent proteins were weak
because they could not be applied very well to people.
Humans are too opaque, thick and opaque for a whole body florescence.
We're not the size of a mouse and the light doesn't penetrate more than a millimeter or two throughout our tissue.
The ugly aspect is that the fluorescent proteins have to be introduced by genetic engineering.
That's the whole point.
They were the first pigments that could be introduced by genetic engineering and only on people,
gene therapy is not sufficiently advanced.
You can do gene therapy on a mouse, but for ethical reasons, you don't want to do gene therapy on people.
At least not in it's current form, not very commonly.
In the introduction of fluorescent proteins generally would not help the patient and that is what would be necessary.
So, for clinical applications we need synthetic molecules to do the equivalent of GFP
but by other means, more traditional means.
That would light up and treat disease tissue and especially cancer.
I focused on cancer because my father died of pancreatic cancer.
Therefore, one of the strong motivations for me, to work on cancer.
There were other motivations, of course.
So, why study proteases?
As it turned out we studied the proteases and the reason was that most cancer deaths occur
due to metastasis, that is the spread of the cancer.
Instead of just a primary tumour, which is some symbolized here,
you are killed by the cancer when the cancer is able to spread uncontrollably to secondary distant sites.
Most of the work on basic biology of cancer is done on primary tumours but the metastasis, which actually kills you,
is when the tissue, the tumor goes beyond the primary tumor.
Cells have to break through a lot of healthy tissue, basement membranes, extracellular matrix, and so on.
And cut its way, like with machetes, waving machetes to carve its way through the jungle.
Then reaches the blood stream and crawls out and then crawl through the blood stream
or lymphatic organ stream and crawls out at the other end.
All of this requires over-expression activation of enzymes that cut proteins because you have to cut through this matrix.
And those are proteases.
Two of the most famous, but not the only ones, obviously, but two of the most famous are matrix metalloproteinase-2 and MMP-9.
They're only just the things for which we have the best reagents.
In fact, this is stolen from a commercial website, which advertises reagents in vitro for checking on MMP-2 and 9.
But we thought that if we could see them in vivo and eventually in a patient, we would have better diagnosis
and treatment options for them.
The biochemical mechanism by which we were going to sense,
we planned to sense the MMP-2 and 9 activities.
It starts with this basic biochemistry fact, which is not due to me, that if you have a payload a
and it is stuck onto a polycation peptide, such as roughly eight or 10 positive charges in a row.
when it put next to cells and here's a cell,
first sticks to the outside of the cell by electrostatic interaction, and then gets endocytosed
or taken up inside the host, target cell.
A little bit can even get into the nucleus.
This is a well-known phenomenon that was already discovered but it is rather non-selective, this uptake is.
We made it a little bit more selective by the following procedure.
We attached two more parts to this polycationic peptide, by the way, that's called a cell penetrating peptide.
We attached a polyanion which had equal number of negative charges.
We attached by means of a cleavable leash or linker.
By putting on a matching number of negative charges to the positive charges that were already there,
the cell uptake fortunately was largely blocked because the pluses and minuses neutralized each other internally,
rather than trying to bind to the negative surface charge of the cell.
This is called an activatable cell penetrating peptide.
In this form, so far, it doesn't do anything but it just waits.
It's got this cleavable portion and it can be cut by the proteases we care about.
And when the proteases, such as MMP-2 and MMP-9 cut the sequence that is built into this protease, this cleavage sequence,
then they cut, snip, they snip it apart and the halves drift apart and you get a couple of copies of polyanion
which you then throw away.
Result is also the freeing up of the original polycation payload, the CPP, which then does its normal thing.
Wherever the protease activity resides it's like getting a little microinjection,
not a physical injection but a microscopic injection of the polycation payload.
So, I'll cut through all the, I'll just try to show you how it actually works, in principle.
So can you see the tumor?
This is in the middle of an operation.
We're carving up the tissue.
It happens to be a mouse.
Obviously, under anesthesia.
But, I challenge you to tell what is the tumor and what is not.
The surgeons have been using, having difficulty for years and years, for thousands of years, telling cancerous tissue from healthy tissue.
Now we turn on the fluorescent light and we use fluorescence imaging and a bit of an image processing.
And now we can clearly see, not only even where the tumor is but how much tumor but how much tumor
is at the edges, it's a mixture of tumour and normal and how active is the MMP enzymes by the colour coding built in.
So now you can see by the help of the fluorescence imaging all the...
obviously makes it much easier to cut the tumour accurately.
By comparing fluorescence guided surgery with the lights on versus white light reflectants,
which is your ordinary naked colour vision, using just white light, you can see in these so called Kaplan-Meier plots.
These are the plots of time versus the operation time since the operation,
as for example here, twenty five weeks after the operation.
As you successfully go on the tumour recurrence,
because of not having accurate enough
surgery initially gives you this white light reflectants.
This is the performance curve of the traditional method, but FGS does much better.
In other words, in this case a great many more mice were still cured.
Not all of them but many more.
The same is true in a pancreatic model or in a parotid model of cancer.
We can go on and on.
Even, just in the pancreatic model, white light reflectants leaves a good deal of tumour, whereas the fluorescent guided surgery
the tumour can be verified to have been left behind is almost eliminated.
This is a complicated story but the same mechanism of cleavage-activated uptake, I have shown you,
can deliver a contrast agent for optical imaging.
Not shown but also there, is magnetic resonance imaging and actually delivery of drugs and radiation synthesizers,
but there has not been time to show you.
The linkers can be cleaved by proteases.
It offers enzymatic application because one molecule of protease can cause many molecules to be taken up.
Protease activities are good markers, not only for metastatic ability, that's the MMP-2 and MMP-9 that I talked about,
but also for inflammation, thrombosis, ischemic cascades, and so on.
For more cardiovascular type of applications, but you have to change the focus to sense thrombin instead of MMPs.
I don't have time to show you that.
Earliest clinical judgement application is an image guided surgery.
I tried to show you how you could help.
Drug delivery will be more challenging because because background labelling cannot be filtered by clinical judgment.
It is good, I think, to help the surgeon, because tumours cannot acquire resistance to surgery.
That's the one very big advantage of surgery.
If you actually cut it out, the tumour, and drop it in formaldehyde.
I don't care how much it wants to grow back or how rugged the cells are, they're dead.
Okay, if tumour is in non-essential tissue and it can be detected early enough,
then surgery usually offers a complete cure.
It was important to work in vivo, we found, and directly with clinicians obviously.
I can't cut open a mouse let alone a human being.
The future success or failure obviously will hinge on clinical trials because in my lab we could demonstrate the workings
on a mouse but who cares about them.
It's whether it will really, really, really work on people, work in people.
And fortunately just about a week or two ago the small company of Avelas Biosciences treated its first patient.
So finally, at long last, it is put into humans
and the patient, so far, did perfectly well.
But there is a very long road of development ahead of us,
before we know whether it's truly valuable.
Now, I'd like to switch to the neurobiological story, life-long memories.
We are hypothesizing our story as a pattern of holes in the perineuronal net, the PNN.
The PNN is a specialized form of extracellular matrix deposited around neurons during critical periods
in development in the brain.
The PNN is interrupted by holes.
The holes are the places that synapses occur.
Large holes in the insulation material, that is in the insulation caused by the PNN,
correspond to large synaptic context.
That can be strong.
Small holes in the PNN give a weak synapses, no holes, gives no synapses, and no connections.
PNN is there for like an enormous punch card in 3-D.
The one problem is I recognize that all of you people, these young students, have probably never even seen a punch card.
That was very common in my era
but at least look up what it looks like.
The crucial idea is that the stability of synaptic strengths and therefore memories,
we respect Donald Hebb here, stems from the stability of the PNN, whose molecules can individually last a lifetime.
Single molecules of extracellular matrix.
Whereas, the molecules that everyone had thought of that were actively retaining memory, such as the actual macromolecules
that make up the synapses themselves, turn over in just a few days, and just turn over continually.
For your lifetime.
We don't need to postulate a copying mechanism that preserves information faithfully over hundreds or thousands of generations.
If you believe that macromolecules, synaptic macromolecules are the source site of memory, you then are trying to stabilize
a picture in writing on water.
You’re trying to, you will have to have a copying mechanism that preserves information
even though the individual molecules are turning over.
How does this happen?
Intracellular molecules always have an automatic turn-over mechanism
which is the proteasome and so on.
The phenomena discovered by Hershko and Chiechanover, who got Nobel Prizes and are talking at this meeting.
Fortunately, extracellular matrix lacks an automatic turn-over.
When you need, want to turn over the extracellular matrix and remodel it, there are ways but you have to have specific proteases.
This is a little bit closer look at the perineuronal net and it consists of chondroitin sulfate proteoglycans,
CSPG's, with these sorts of names, Aggrecan, Versica, and so on.
Held together by carbohydrate chains anchored into the plasma membrane.
By the way, morphologically as opposed to biochemically they were already known quite a long time ago.
The great pioneer Ramon y Cajal who got, I believe he got his own Nobel Prize in the early part of the century.
He could see them.
In a more modern way of looking at them we visualize green, the chondroitin sulfate proteoglycans versus in purple,
prosynaptic density, protein 95, a traditional marker of this synapses.
You see some of the relationship between the two.
One of them is, they interweave but don't overlap.
That is the PNN versus the synapsis.
We can also look at the hyaluronan or some of the link proteins.
The same story we can see.
That was in culture.
We believed that during the critical period during which the PNN is first laid down,
in mice that is predominately about four weeks old.
Four weeks of age and the period from four weeks to six weeks is the time that the PNN is laid down.
Then after that if learning is to occur the very, very locally and microscopically, the PNN is further degraded at defined sites
and creates a hole.
And this allows the synapses to go from this state, which is no synapse to a strong synapse when the PNN
has been destroyed at the position of the synaptic cleft.
The negative image of this PNN is formed
and permits the synapses to poke it's head through.
This is a more modern
electron micrograph
and in this here's the whole cell enlargement here.
You can see a presynaptic of the upstream portion of the neuron, and the downstream portion, and this is a synaptic communication.
Everywhere else, but the synapses is the jacket of PNN which preserves the position of the synapses, we believe.
The half-life of the neuronal intracellular proteins is,
as I said, then known to be rather short.
Some three or four days half-life.
If you try to store memory, as I said into something in which only last three or four days
and yet the memory last for 80 years say, as for an age of a human being, you would have to have about 8,000 generations
of copying and recopying and recopying.
We tried to test this by what is the actual length of time of the perineuronal net, which had never been looked at.
How stable are those proteins?
We postulate today that they are stable but is it proven?
Well, the way we did is take nitrogen, normal mouse, and they normally have essentially 100% nitrogen 14,
the normal stable isotope of nitrogen.
Then we started feeding them for ten weeks with nitrogen 15.
This is a rather experiment, you have to by a lot of mouse chow, expensive mouse chow,
which is specially modified so that only the nitrogen is nitrogen 15.
Then after ten weeks we gave them one week of happy time with the mating,
the male mice could fortunately be with back to the 14.
Three weeks while they gestated, and then finally they gave birth.
Then the next generation we kept them to day 45 or six weeks.
We had in essence twenty weeks of labelling.
That is essential because the brain very, very slowly does it equilibrate with the food that it eats.
It's not every day.
It's the brain recycles it's aminoacids so you have to do extra hard work.
When we sacrifice the cohort which we placed back in nitrogen 14 food, the most meaningful was six months feeding.
After 180 days continued feeding of nitrogen 14, after 20 weeks initially, all the traditional candidates are already
back to nitrogen 14, because they've had many chances to wash out the nitrogen 15.
But the perineuronal net, as shown by Versicans and the hyaluronan link proteins have retained the most nitrogen of nitrogen 15.
Not all but a large amount
retains quite as well as myelin basic protein, which is one of the most stable proteins in the brain.
This we consider constitutes evidence that nitrogen,
that the perineuronal net is indeed can be stable
for long periods of time.
Much more stable than the synapses.
So proposed molecular memory mechanisms have been several in the literature.
CaM kinase 2 was proposed by John Lisman for the site of memory.
Todd Sacktor put forward PKMzeta.
Eric Kandel, a famous neuroscientist, who's a Nobel Prize winner himself, proposed CPEB, translation factor.
All of these are intracellular proteins.
They have up the problem and very elaborate mechanism that you have to postulate
for how the memory could be a single train molecule, can passage message to a second progeny molecule.
Whereas, we believe that none is required.
The molecules themselves don't have to be copied.
We think that the mechanism activation will be proteolytic attack by the local degradation
and formation of which allows the strengthening of synapses in the vacant space.
The read out mechanism is this competition with synapses for space.
You either have PNN or the synapses.
The PNN mechanism
will give you a very low vulnerability to metabolic interruption.
If you have a coma, for example, or cool the brain,
all these intrasynaptic mechanisms will be vulnerable to metabolic interruption.
The perineuronal net is a stable and it is non energy requiring
to survive and it's just going to give you a much lower vulnerability.
Also, it can explain critical periods.
Now, what about the literature evidence?
Literature evidence already says that there is a good deal,
that the PNN can act as, can be served as proteolytic degradation such as the protease MMP-9.
If you check they are locally translated and secreted to response to synaptic activity.
If you puff and dodge exogenous
MMP 9 from a bottle, if you puff it on locally you can provoke spine enlargement synaptic potentiation.
Here's an experiment which is done on a whole animal.
Global disruption of the PNN, for example, the special enzyme can actually reopen the critical periods and it call allow animals
which have undergone monocular deprivation.
Which are normally then stable but after this experimental procedure injection
of enzyme into the brain to weaken the perineuronal net again, you can get a second round of training
which reverses monocular deprivation.
Then similarly you can wipe out fear memories and make them susceptible to erasure.
Inhibitors have been claimed to cause late phase synaptic potentiation.
Other enzymes, by the way, are very likely to be important, but we just don't know enough about these enzymes.
The MMP's, you can buy them, EMP Sciences makes them
and makes reagents, but the other enzymes that are also important.
You can't buy so the emphasis, we have deliberately emphasized, such as MMP-2 and 9.
Now convincing direct truth would be implantation and deletion of specific memories, but this would require knowing
how synaptic activity encodes experiences.
If any were in the audience for Professor Tony Gabel's talk early this morning you know that we're very, very close
or even possibly there at this challenge.
The one experiment and the final experiment that I will describe to you is we tried to inhibit MMP-9 and we said it's known
to prevent synaptic growth but we wanted to check whether it affects the mice
behavior.
Therefore we did an experiment of this sort.
We compared their ability to recall within only 24 hours, which is a long period by ordinary standards
but for us it's a short time.
We compared it to a testing them fully one month later, 30 days later.
We either injected nothing or DMSO, inert substance, or the drug Prinomastat which is an inhibitor of matrix metalloproteinases,
or we used transgenic mice.
After 24 hour cue test not much was changed.
Depending on whether we interfered with the PNN proteases or not.
If after 30 days and testing them with the cue of the sound pulse about half the memory was gone,
was half as strong.
If we used Prinomastat relative to control or we did the genetic knock out with either,
obviously once you've knocked it out genetically
you don't care whether you further give it Prinomastat.
In neither of these conditions by inhibition of MMP-9 we blocked about half of the memory.
Now, the problem of course, is that MMP-9 is only one enzyme and we don't think that it's responsible
for all the enzymes but it may be responsible for half.
My lessons from these two topics.
First thing is that their surprising role of extracellular matrix and MMPs.
I take this as rather significant because all my original career and all the work of GFP
was intended at strengthening intracellular mechanism and our ability to watch intracellular signal induction.
Here am I being forced to learn about extracellular matrix.
Basic and applied research, applied research for the cancer, basic research for the memory can be of equal value and difficulty.
Finally, there is a genuine likelihood of failure in these examples that I've given.
These are very recent.
If I gave you reminiscences about GFP or take an example, if you go and watch most movies,
say you go and watch a James Bond film.
You know that there is success at the end.
The hero lives to fight another day.
No matter what risk he takes he survives and triumphs.
James Bond always triumphs.
Similarly across many, many movies.
Of course, here at Lindau, every time you hear Nobel Laureate do retrospective of, "How I got the Nobel Prize,"
that has no likelihood of failure.
This is still got plenty of chances to fail.
Most preclinical avenues don't reach clinical trials.
Now that we have reached clinical trials most of them will fail.
Chemotherapeutic and genomic approaches are far more popular in cancer research than helping surgeons.
Turning down neurobiology, the PNN hypothesis is far from proof of acceptance.
Very, very sketchy evidence right now despite my always talking about postulate.
Practically no one works on it, of the mechanism of the longest term learning or memory.
It's admitted to being of philosophical importance but basically no body works on it.
Finally, anonymous refereed funding and publications are increasingly hard to get.
Whereas others happily tell you about the 10 billion dollars that they spent on their experiment.
We're finding it difficult.
There's distinct possibility yet exists, that I am going senile,
as has happened to other prize winners.
So take everything you heard with a grain of salt at Lindau.
Thank you.
Ich würde Ihnen heute gerne zwei verschiedene Geschichten erzählen.
Eine Geschichte ist über das jüngste Molekül, das wir gegen Krebs entwickelt haben, sie werden überwiegend
aktivierbare zelldurchdringende Peptide, ACPPs genannt.
Die primäre Verwendung ist der Einsatz für Fluoreszenz-Bildgebung von Matrix-Metalloproteinase-Aktivitäten
oder sie können zur gezielten Chemotherapie und Strahlentherapie verwendet werden,
aber ich habe keine Zeit, um dies hier zu erläutern.
Die Personen in meinem Labor und unsere externe Mitarbeiter sind hier aufgeführt, aber ich habe einen Interessenkonflikt hinsichtlich
der Offenlegung.
Ein neues Unternehmen, Avelas Biosciences, hat begonnen, diese synthetischen Sonden zu kommerzialisieren,
und ich und einige Mitarbeiter meines Labors, unsere Berater, Mitarbeiter, besitzen einige Aktien der Gesellschaft.
Daher muss man die Interessenkonflikte im Auge behalten.
Außerdem eröffnet es die Möglichkeit, dass ich in der zweiten Hälfte über die langfristigen Perspektiven sprechen kann.
Bei der anderen Geschichte handelt es sich um Moleküle, die die Natur nutzt, um Erinnerungen in unserem Gehirn zu speichern
und das ist die Neurobiologie für das perineurale Netz.
Die Personen, die hieran beteiligt sind, sind Varda Lev-Ram, Sakina Palida mit etwas Hilfe von Massenspektrometer-Kollegen.
Das ist eine ganz andere Geschichte.
Eine ganze Menge mehr Grundlagenforschung statt der angewandten Forschung.
Sie erscheinen sehr unterschiedlich, aber am Ende werde ich versuchen, Ihnen zu zeigen, dass es sowohl bestimmte überraschende Ähnlichkeiten
als auch Gegensätze gibt.
Zuerst muss ich erklären, warum ich den Nobelpreis erhielt und warum ich nicht mehr in diesem Bereich arbeite.
Einige der fluoreszierenden Proteine, die im Jahr 2004 zur Verfügung standen, in dieser berühmten Zusammenfassung auf einer Folie,
sie codieren die schönen Farben des Regenbogens.
Jedes dieser Röhrchen enthält das fluoreszierende Protein und jedes fluoreszierende Protein ist durch DNA codiert,
nicht-toxisch, synthetisierbar durch jeglichen aeroben Organismus.
Und übrigens, wenn Sie ein Chemiker sind - wie Sie wissen erhielt ich den Chemienobelpreis -,
muss man erwähnen, dass sie mit 230 Verdichtungen der Zyklisierung und jeglicher Oxidation, in einer hundert Prozent Ausbeute,
einem wässrigen Medium synthetisiert sind und es nur ein wenig Wasserstoffperoxid als Nebenprodukt gibt.
Das zeigt, wie gut ein Chemiker der Natur im Vergleich zu uns gewöhnlichen Chemikern ist.
Aber fluoreszierende Proteine haben Vor- und Nachteile.
Gut ist, dass das fluoreszierende Protein einen großen Einfluss auf die biomedizinische Grundlagenwissenschaft hat.
Die wichtigsten Proteine und biochemische Schlüsselschritte.
Letztlich waren wir in der Lage, sie uns in lebenden Zellen oder Modellorganismen von Hefe, Würmern, Fliegen, Mäusen usw. darzustellen.
Andere Leute, viele von ihnen Nobelpreisträger in der Super-Resolution-Technologie, erhielten gewissen Nutzen aus unseren
fluoreszierenden Proteine, etc.
Aber ich hatte das Gefühl, dass die fluoreszierende Proteine leider schwach waren, weil sie nicht sehr gut bei Menschen
angewendet werden konnten.
Der Mensch ist zu undurchsichtig, zu dick und undurchsichtig für eine Ganzkörper-Fluoreszenz.
Wir haben nicht die Größe einer Maus, und das Licht durchdringt nicht mehr als einen oder zwei Millimeter unseres Gewebes.
Ein hässlicher Aspekt ist, ist dass die fluoreszierenden Proteine mithilfe von Gentechnik eingeführt werden müssen.
Das ist der springende Punkt.
Sie waren die ersten Pigmente, die durch Gentechnik eingeführt werden konnten, und nur für Menschen ist
die Gentherapie ist nicht weit genug fortgeschritten.
Sie können Gentherapie an einer Maus anwenden, aber aus ethischen Gründen, kann keine Gentherapie an Menschen angewendet werden,
zumindest nicht in seiner derzeitigen Form und nicht verbreitet.
Die Einführung von fluoreszierenden Proteinen würde in der Regel den Patienten nicht helfen, und das wäre erforderlich.
Für klinische Anwendungen brauchen wir synthetische Moleküle, um das Äquivalent von GFP zu erzielen,
aber durch andere Mittel, traditionellere Mittel,
die das erkrankte Gewebe durchleuchten und behandeln würde, besonders Krebs.
Ich konzentrierte mich auf Krebs, weil mein Vater an Bauchspeicheldrüsenkrebs verstorben war.
Daher war eine der starken Motivationen für mich an Krebs zu arbeiten.
Es gab natürlich auch andere Motive.
Warum also sollte man Proteasen studieren?
Wir untersuchten die Proteasen und der Grund dafür war, dass die meisten krebsbedingten Todesfälle aufgrund Metastasen auftreten, also der
Ausbreitung des Krebses.
Statt nur eines Primärtumors, der hier dargestellt wird,
werden Sie durch den Krebs getötet, wenn der Krebs in der Lage ist, sich unkontrolliert zu sekundär entfernten Orten zu verteilen.
Die meiste Arbeit zur grundlegenden Biologie von Krebs wird an Primärtumoren durchgeführt, aber es sind
die Metastasen, die einen tatsächlich umbringen, wenn das Gewebe, wenn der Tumor sich über den Primärtumor hinaus entwickelt.
Zellen müssen durch eine Menge gesundes Gewebe, Basalmembranen, extrazellulären Matrix, usw. brechen.
Seinen Weg mit Macheten, schwingenden Macheten, durch den Dschungel schneiden.
Dann erreicht es die Blutbahn und kriecht dann durch den Blutstrom oder das lymphatische Organ und kriecht
am anderen Ende heraus.
All dies erfordert eine Überexpression oder Aktivierung von Enzymen, die Proteine durchschneiden,
denn man muss durch diese Matrix gelangen.
Das sind die Proteasen.
Zwei der bekanntesten, aber offensichtlich nicht die einzigen, aber zwei der berühmtesten sind Matrix-Metalloproteinase-2 und MMP9.
Sie sind gerade die Dinge, für die wir die besten Reagenzien haben.
In der Tat wurde dies von einer kommerziellen Website gestohlen, die Werbung für Reagenzien In-Vitro macht, um MMP 2 und 9 zu prüfen.
Aber wir dachten, dass, wenn wir sie in vivo sehen könnten, und schließlich bei einem Patienten,
wir eine bessere Diagnose und Behandlungsmöglichkeiten bieten könnten.
Der biochemische Mechanismus, mit dem wir die MMP 2 und 9-Aktivitäten erfassen wollten,
beginnt mit dieser grundlegenden Biochemie-Tatsache, die nicht von mir stammt: Wenn man eine Nutzlast hat und diese
auf einem Polykation-Peptid gesteckt wird, ungefähr acht oder zehn positive Ladungen in einer Reihe.
Wenn dieses neben Zellen gesetzt wird - hier ist eine Zelle -, dann haftet es erst an der Außenseite der Zelle
durch elektrostatische Wechselwirkung, und wird dann abgeschnürt oder in den Host, der Zielzelle, aufgenommen.
Ein wenig kann sogar in den Zellkern gelangen.
Dies ist ein bekanntes Phänomen, das bereits entdeckt wurde, aber diese Aufnahme ist nicht selektiv.
Wir haben es durch das folgende Verfahren ein wenig selektiver gemacht.
Wir befestigten zwei weitere Teile an dieses polykationische Peptid, es wird übrigens zelleindringendes Peptid genannt.
Wir befestigten ein Polyanion mit der gleichen Anzahl von negativen Ladungen.
Wir befestigten es mithilfe einer abspaltbaren Leine oder Linker.
Indem eine passende Anzahl von negativen Ladungen an positive Ladungen, die bereits da waren, gebunden werden,
wurde die Zellaufnahme glücklicherweise weitgehend blockiert, weil sich plus und minus intern gegenseitig neutralisierten,
anstatt zu versuchen, sich an die negative Oberflächenladung der Zelle zu binden.
Dies wird aktivierbarer zellpenetrierendes Peptid genannt.
In dieser Form tut es nichts, es wartet nur.
Es hat diesen spaltbaren Teil und es kann durch die Proteasen, die uns wichtig sind, durchschnitten werden.
Wenn die Proteasen, wie MMP2 und MMP9 die Sequenz, die in dieser Protease eingebaut ist, durchschneidet, diese Spaltsequenz,
dann schnippeln sie es auseinander und die Hälften driften auseinander,
und man erhält ein paar Kopien von Polyanion, die man dann wegwirft.
Das Ergebnis ist auch die Freisetzung der ursprünglichen Polykation-Nutzlast, das CPP, was dann seiner normalen Sache nachgeht.
Wo auch immer sich die Protease-Aktivität befindet, es ist wie als ob man eine Mikroinjektion erhält,
keine physische Injektion, aber eine mikroskopische Injektion der Polykations-Nutzlast.
Ich schneide also durch alles das durch, Ich versuche Ihnen zu zeigen, wie es wirklich im Prinzip funktioniert.
Können Sie den Tumor zu sehen?
Hier befinden wird uns in der Mitte einer Operation.
Wir teilen das Gewebe.
Es ist eine Maus,
naheliegenderweise unter Anästhesie.
Ich stelle Sie vor eine Herausforderung, mir zu sagen, was ein Tumor ist und was nicht.
Die Chirurgen hatten jahrelang Schwierigkeiten, Tausende von Jahren, Krebszellen von
gesunden Zellen zu unterscheiden.
Nun schalten wir das Fluoreszenzlicht an wir verwenden Fluoreszenz-Imaging und ein bisschen Bildverarbeitung.
Jetzt können wir es deutlich sehen, nicht nur wo genau der Tumor ist, sondern auch wie weit verbreitet er ist -
an den Kanten befindet, es ist eine Mischung von Tumor- und normalen Zellen und wie aktiv die MMP-Enzyme sind,
durch die eingebaute farbige Markierung.
Mit Hilfe des Fluoreszenz-Imaging ist
es selbstverständlich viel einfacher, den Tumor richtig herauszuschneiden.
Durch den Vergleich fluoreszenz-geführter Chirurgie mit angeschaltetem Licht verglichen mit weiß reflektierenden Lichtern -
also Ihr Sehen von Farben mit dem bloßen Auge, wenn man weißes Licht verwendet -, können Sie die so genannten Kaplan-Meier-Plots sehen.
Hierbei handelt es sich um die Zeitplots im Vergleich zur Operationszeit seit der Operation,
wie zum Beispiel hier, 25 Wochen nach der Operation.
Bei einem erfolgreichen Wiederauftreten des Tumor, weil Sie die Operation vorher nicht genau genug durchführen konnten,
sehen Sie diese weißen Lichtreflexionen.
Dies ist die Leistungskurve der traditionellen Methode, aber FGS funktioniert viel besser.
Anders gesagt, in diesem Fall wurden eine größere Anzahl von Mäusen noch geheilt -
nicht alle, aber viele mehr.
Das Gleiche trifft auf ein Pankreasmodell oder bei einem Modell des Ohrspeicheldrüsenkrebses zu.
Davon gibt es noch viele weitere Beispiele.
Selbst beim Pankreasmodell hinterlassen die weißen Lichtreflektoren einen großen Teil des Tumors während bei der fluoreszierenden
geführten Chirurgie, der zurückgelassene Tumor nahezu eliminiert werden konnte.
Dies ist eine komplizierte Geschichte, aber der gleiche Mechanismus der Spaltung aktivierter Aufnahme, die ich Ihnen gezeigt
habe, kann ein Kontrastmittel für die optische Abbildung liefern.
Nicht angezeigt, aber auch vorhanden, ist die Magnetresonanztomographie und die tatsächliche Lieferung von Medikamenten und
Strahlungs-Sensibilisatoren, aber es bleibt keine Zeit, um Ihnen das zu zeigen.
Die Linker können durch Proteasen gespalten werden.
Es bietet enzymatische Anwendung, da ein Molekül Protease dazu führen kann, dass viele Moleküle aufgenommen werden können.
Protease-Aktivitäten sind gute Marker, nicht nur für die Metastasierungsfähigkeit, also die zuvor genannten MMP2 und MMP9,
aber auch für Entzündungen, Thrombose, ischämische Kaskaden usw.,
für eher Herz-Kreislauf-Typ-Anwendungen, aber Sie müssen den Fokus ändern, um Thrombin statt MMPs wahrzunehmen.
Ich habe keine Zeit, Ihnen das zu zeigen.
Früheste klinische Anwendung entspricht einer bildgeführten Chirurgie.
Ich habe versucht, Ihnen zu zeigen, wie Sie helfen können.
Die Medikamentenabgabe wird schwieriger, weil Hintergrundkennzeichnung nicht durch klinische Beurteilung gefiltert werden kann.
Ich glaube, es ist gut, dem Chirurgen zu helfen, weil Tumore gegenüber den Chirurgen nicht resistent sind.
Das ist der einzige sehr große Vorteil einer Operation.
Wenn Sie den Tumor herausschneiden und ihn in Formaldehyd legen.
Es ist mir egal, wie sehr es wieder zurückwächst oder wie robust die Zellen sind, sie sind tot.
Ok. Wenn der Tumor sich in nicht wesentlichem Gewebe befindet und es früh genug entdeckt werden kann,
dann bietet eine Operation in der Regel eine vollständige Heilung.
Wir fanden, dass es war wichtig, in vivo zu arbeiten, direkt mit Ärzten.
Ich kann eine Maus nicht aufschneiden, geschweige denn einen Menschen.
Der zukünftige Erfolg oder Misserfolg ist offensichtlich von klinischen Studien abhängig, weil wir in meinem Labor
die Arbeiten an einer Maus zeigen konnten, aber wen interessieren schon die Mäuse.
Es geht darum, ob es wirklich bei Menschen funktioniert.
Und zum Glück nur vor ein oder zwei Wochen behandelte das Unternehmen Avelas Biosciences ihren ersten Patienten.
Endlich wird es also auch bei Menschen ausprobiert, und soweit geht es dem Patienten sehr gut.
Aber ein sehr langer Weg der Entwicklung liegt vor uns, bevor wir wissen, ob es wirklich von Bedeutung ist.
Jetzt möchte ich zur neurobiologischen Geschichte, den lebenslangen Erinnerungen wechseln.
Wir haben die Hypothese, dass unsere Geschichte wie ein Muster von Löchern im perineuralen Netz, dem PNN gespeichert ist.
Das PNN ist eine spezielle Form der extrazellulären Matrix, das während der kritischen Phasen der Entwicklung im Gehirn
um die Neuronen herum abgeschieden wird.
Das PNN ist von Löchern unterbrochen,
und in den Löchern treten die Synapsen auf.
Große Löcher im Isolationsmaterial, das in der Isolierung durch das PNN verursacht wird,
entsprechen großem synaptischen Kontext.
Das kann ausgeprägt sein.
Kleine Löcher im PNN ergeben schwache Synapsen, keine Löcher ergeben keine Synapsen und keine Verbindungen.
PNN ist daher wie eine riesige Lochkarte in 3-D.
Das einzige Problem, das ich erkenne, dass alle von Ihnen, die jungen Studenten, wahrscheinlich noch nie eine
Lochkarte gesehen haben.
In meiner Zeit war es ganz normal, aber schauen Sie nach, wie es aussieht.
Die entscheidende Idee ist, dass die Stabilität der synaptischen Stärken und daher die Erinnerungen -
wir respektieren Donald Hebb hier - sich aus der Stabilität des PNN ergibt,
dessen individuelle Moleküle ein Leben lang erhalten bleiben können.
Einzelmoleküle der extrazellulären Matrix.
Wohingegen die Moleküle, von denen jeder dachte, dass sie aktiv Erinnerungen speichern, wie beispielsweise die tatsächlichen Makromoleküle,
aus denen die Synapsen selbst bestehen, sich in nur ein paar Tagen wenden, und dies tun sie kontinuierlich -
Ihr ganzes Leben lang.
Wir brauchen kein Kopiermechanismus zu fordern, der Informationen getreu über Hunderte oder Tausende von Generationen hinweg aufbewahrt.
Wenn Sie glauben, dass synaptische Makromoleküle die Quelle der Erinnerungen sind,
dann versuchen Sie ein Bild zu stabilisieren, indem Sie auf dem Wasser schreiben.
Sie brauchen einen Kopiermechanismus, das Informationen bewahrt, selbst dann, wenn sich die individuellen Moleküle wenden.
Warum ist das so?
Intrazellulären Molekülen haben immer einen automatischen Wendemechanismus,
das Proteasom und so weiter -
das von Hershko und Chiechanover entdeckte Phänomen, die Nobelpreisträger sind und hier Reden halten.
Glücklicherweise fehlt der extrazellulären Matrix ein automatischer Wendemechanismus.
Wenn Sie eine extrazelluläre Matrix wenden möchten und sie umbauen wollen, dann geht das, aber Sie brauchen spezifische Proteasen.
Hier ist ein genauerer Blick auf das perineuronale Netz, und es besteht aus Chondroitinsulfat-Proteoglykanen,
CSPGs mit Namen wie Aggrecan, Versica und so weiter.
Zusammengehalten von Kohlenhydratketten, die in die Plasmamembran verankert sind.
Übrigens waren sie morphologisch - im Gegensatz zu biochemisch - schon seit langer Zeit bekannt.
Der große Pionier Ramon y Cajal, der seinen Nobelpreis in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts erhielt,
er konnte sie sehen.
In einer moderneren Art der Betrachtung, visualisieren wir die Chondroitinsulfat-Proteoglykane in grün
im Gegensatz zu der prosynaptischen Dichte von Protein 95 in lila,
was ein traditioneller Marker dieser Synapse ist.
Sie sehen eine Art Beziehung zwischen den beiden.
Sie sind miteinander verflochten, aber sie überlappen nicht.
Das ist das PNN gegenüber der Synapse.
Wir können auch auf die Hyaluronsäureketten schauen oder auf einige der Linkproteine.
Da sehen wir dasselbe.
Das war in einer Kultur.
Wir glaubten, dass in der kritischen Zeit, während das PNN zunächst in Mäusen festgelegt
wird, dass es überwiegend etwa vier Wochen alt ist.
Vier Wochen alt und zwischen 4 und 6 Wochen wird das PNN festgelegt.
Danach, wenn Lernphasen eintreten,
dann wird sehr lokal und mikroskopisch das PNN an definierten Stellen weiter abgebaut und ein Loch entsteht.
Und dies ermöglicht den Synapsen, von diesem Zustand, also keiner Synapse, zu einer starken Synapse zu wechseln, wenn das PNN
an der Position des synaptischen Spalt zerstört worden ist.
Das negative Bild einer PNN wird gebildet und ermöglicht es der Synapse, ihren Kopf durchzustecken.
Dies ist ein halbwegs modernes Elektronenmikroskopbild und hier ist die gesamte Zellvergrößerung.
Sie sehen eine Präsynapsis des stromaufwärtigen Abschnitts des Neurons und den stromabwärtigen Abschnitt,
und hier haben wir eine Synapsen-Kommunikation.
Überall außer bei den Synapsen ist der Mantel des PNN, das, wie wir glauben, die Position der Synapsen bewahrt.
Die Halbwertszeit der neuronalen intrazellulären Proteine ist, wie gesagt, ziemlich kurz,
einige 3 oder 4 Tage Halbwertszeit.
Wenn Sie versuchen, Erinnerungen in etwas zu speichern, dass nur 3 oder 4 Tage hält und die
Erinnerungen 80 Jahre lang bewahren wollen, also ein Leben lang, dann braucht man etwa 8000 Generationen von Kopiermechanismen.
Wir haben versucht, dies anhand der tatsächlichen Zeitdauer des perineuralen Netzes zu messen, was zuvor nie in Betracht gezogen wurde.
Wie stabil sind diese Proteine?
Wir haben vorausgesetzt, dass sie stabil sind, aber ist dies auch erwiesen?
Wir erwiesen es, indem wir eine normale Maus nahmen, und sie haben in der Regel im Wesentlichen 100% Stickstoff 14,
das normale stabile Isotop von Stickstoff.
Dann begannen wir sie zehn Wochen lang mit Stickstoff 15 zu füttern.
Hierbei handelte es sich um ein Experiment, man braucht eine Menge Mäusefutter, teures Mäusefutter,
das speziell so modifiziert ist, dass der Stickstoff nur Stickstoff 15 ist.
Dann, nach 10 Wochen gaben wir ihnen eine Woche Zeit zum Paaren, die männlichen Mäusen konnten wieder zurück auf Stickstoff 14.
Drei Wochen hatten sie Tragezeit, und dann kamen die Jungen zur Welt.
Die nächste Generation behielten wir bis zum 45. Tag oder sechs Wochen.
Im Wesentlichen hatten wir 20 Wochen zur Markierung.
Das ist wichtig, weil sich das Gehirn nur sehr, sehr langsam der Nahrung, die es bekommt, anpasst.
Das passiert nicht jeden Tag.
Das Gehirn recycelt Aminosäuren, so dass Sie extra hart arbeiten müssen.
Wenn wir die Kohorte opfern, die wir zurück auf Stickstofflebensmittel 14 Lebensmittel,
war das Wichtigste die sechs Monate lange Fütterung.
Nach 180 Tagen fortgesetzter Zuführung von Stickstoff 14, zunächst nach 20 Wochen, sind alle traditionellen Kandidaten bereits wieder
auf Stickstoff 14, weil sie viel Gelegenheit hatten, den Stickstoff 15 loszuwerden.
Aber das perineuronale Netz, wie durch Versikane und die Hyaluronsäure-Linkproteine gezeigt,
behielten den Großteil des Stickstoff 15 bei.
Nicht alles, aber eine große Menge wird genauso gut wie das basische Myelinprotein beibehalten, eines der stabilsten Proteine im Gehirn.
Nach unserer Ansicht stellt dies einen schlüssigen Beweis dafür dar,
dass Stickstoff, durch das perineuronale Netz in der Tat für lange Zeiträume stabil sein kann,
viel stabiler als Synapsen.
Sogenannte vorgeschlagene molekulare Speichermechanismen gab es mehrere in der Literatur.
CaM-Kinase 2 wurde von John Lisman für den Standort des Speichers vorgeschlagen.
Todd Sacktor schlug PKMzeta vor.
Eric Kandel, ein berühmter Neurowissenschaftler, selbst ein Nobelpreisträger, schlug CPEB als Übersetzungsfaktor vor.
Alle diese sind intrazelluläre Proteine.
Sie haben das Problem, dass sie einen sehr aufwendigen Mechanismus haben, sodass man voraussetzen muss,
dass der Speicher ein einziges Zugmolekül sein kann, das eine Nachricht an ein zweites nachkommendes Molekül sendet.
Wohingegen wir glauben, dass keines erforderlich ist.
Die Moleküle selbst müssen nicht kopiert werden.
Wir sind der Meinung, dass die Mechanismus-Aktivierung durch einen proteolytischer Angriff durch den lokalen Abbau
und die Bildung erfolgt, was die Stärkung der Synapsen im freien Raum ermöglicht.
Der Auslesemechanismus erfolgt durch diesen Wettbewerb mit Synapsen für Platz.
Sie haben entweder ein PNN oder die Synapsen.
Der PNN-Mechanismus gibt Ihnen eine sehr geringe Anfälligkeit für Stoffwechselunterbrechungen.
Wenn jemand beispielsweise im Koma liegen, oder das Gehirn gekühlt werden muss,
werden alle diese intrasynaptischen Mechanismen anfällig für metabolische Unterbrechungen.
Das perineuronale Netz ist ein stabiles Tool und erfordert keine Energie um zu überleben, was zu einer geringeren Anfälligkeit führt.
Darüber hinaus kann es kritische Phasen erklären.
Wie sieht es mit den Beweisen in der Literatur aus?
Die Beweise in der Literatur zeigen bereits, dass das PNN dem proteolytischen Abbau dienen kann, wie der Protease MMP 9.
Wenn Sie schauen, sie werden lokal übersetzt und in Reaktion auf die synaptische Aktivität abgesondert.
Wenn Sie exogenes MMP 9 aus einer Flasche weichen lassen, und es lokal auftragen,
können Sie eine Wirbelsäulenerweiterung, synaptische Potenzierung provozieren.
Hier ist ein Experiment, das an einem Tier gemacht wurde.
Globale Störung des PNN, zum Beispiel, dem speziellem Enzym, kann die die kritischen Zeiten wieder öffnen und erlaubt Tieren
visuelle Plastizität, die von monokularer Deprivation betroffen waren.
Die dann in der Regel stabil sind, aber nach dieser experimentellen Verfahrensinjektion von Enzymen ins Gehirn, um das perineuronale Netz
erneut zu schwächen, kann man eine zweite Runde Training erhalten, das die monokulare Deprivation rückgängig macht.
In ähnlicher Weise können Sie Angsterinnerungen auslöschen und sie anfällig für die Löschung machen.
Man hat von Inhibitoren behauptet, dass sie Spätphase synaptische Potenzierung verursachen.
Andere Enzyme sind übrigens sehr wahrscheinlich wichtig, aber wir wissen einfach nicht genug über diese Enzyme.
Sie können die MMPs kaufen, EMP Sciences stellt sie her und macht Reagenzien,
aber die anderen Enzyme, die auch wichtig sind, kann man nicht kaufen, daher
haben wir bewusst MMP 2 und 9 betont.
Nun überzeugend wäre die Implantation und Streichung bestimmter Erinnerungen,
aber dafür müsste man wissen, wie synaptische Aktivität Erfahrungen kodiert.
Wenn jemanden von Ihnen beim Vortrag von Professor Tonegawa heute Morgen beigesessen hat, wissen Sie, dass wir
sehr, sehr nah dran sind, die Herausforderung zu meistern.
Das eine Experiment und das endgültige Experiment, das ich Ihnen beschreiben werde, ist, dass wir versuchten,
MMP9 zu hemmen und wir sagten, das man es zur Verhinderung synaptischen Wachstum kennt.
aber wir wollten prüfen, ob es sich auf das Verhalten der Mäuse auswirkt,
daher führten wir folgendes Experiment durch.
Wir verglichen ihre Fähigkeit innerhalb von nur 24 Stunden sich zu erinnern, was eine lange Zeit für sie ist, aber nur sehr kurz für uns.
Wir verglichen es mit einem Test einen ganzen Monat später,
Wir injizierten entweder nichts oder DMSO, eine inerte Substanz, oder das Medikament Prinomastat,
das ein Inhibitor der Matrix-Metalloproteinasen ist, oder wir verwendeten transgene Mäuse.
Nach 24 Stunden Cue-Test veränderte sich nicht viel.
Je nachdem, ob wir in die PNN Proteasen eingriffen oder nicht.
Nach 30 Tagen und nachdem sie mit dem Schallimpuls getestet wurden,
existierte etwa die Hälfte der Erinnerungen nicht mehr, oder war halb so stark.
Ob wir Prinomastat zur Steuerung verwendeten oder wir den genetischen Knock-out umsetzten -
natürlich, sobald man es genetisch ausgeschaltet hat,
ist es egal, ob man es weiter Prinomastat verabreicht. Unter jeder dieser Bedingungen durch Inhibierung von MMP9
blockierten wir etwa die Hälfte der Erinnerungen.
Jetzt ist natürlich das Problem, dass MMP9 nur ein Enzym ist, und wir glauben nicht, dass es
für alle Enzyme verantwortlich ist, aber es kann für die Hälfte verantwortlich sein.
Meine Lehren aus diesen beiden Themen.
Zunächst einmal, ihre überraschende Rolle bei der extrazellulären Matrix und MMPs.
Ich finde dies recht bedeutsam, weil alles in meiner ursprünglichen Karriere und die ganze Arbeit
von GFP auf die Stärkung des intrazelluläre Mechanismus und unsere Fähigkeit, intrazelluläre Signalinduktion
beobachten zu können, ausgelegt war.
Hier war ich gezwungen, über die extrazelluläre Matrix zu lernen.
Grundlagen- und angewandte Forschung - angewandte Forschung für Krebs, Grundlagenforschung für Erinnerungen -
können gleich wertvoll und problematisch sein.
Und abschließend: Es gibt eine echte Ausfallwahrscheinlichkeit in den genannten Beispielen.
Es sind Beispiele aus jüngster Zeit.
Wenn ich Ihnen Erinnerungen zu GFP liefere oder Ihnen ein Beispiel gebe, wenn Sie sich einen Film anschauen,
sagen wir Sie einen James Bond Film.
Dann wissen Sie, dass es ein Happy End gibt.
Der Held überlebt, um weiter zu kämpfen.
Egal, welche Risiken er auf sich nimmt, er überlebt und triumphiert, James Bond triumphiert immer.
So ähnlich wie in vielen, vielen Filmen.
Natürlich hier in Lindau hören Sie jedes Mal, Nobelpreisträger, die in die Retrospektive gehen "Wie ich meinen Nobelpreis erhielt" -
hier gibt es keine Ausfallwahrscheinlichkeit.
Dies hier kann immer noch scheitern.
Die meisten präklinischen Wege erreichen keine klinischen Studien.
Jetzt, da wir klinische Studien erreicht haben, werden die meisten von ihnen scheitern.
Chemotherapeutische und genomische Ansätze sind in der Krebsforschung weitaus populärer, als Chirurgen zu helfen.
Die Neurobiologie abzulehnen, die PNN-Hypothese ist noch lange nicht akzeptiert.
Momentan gibt es sehr lückenhafte Beweise obwohl ich immer von Postulaten rede.
Niemand arbeitet daran, am Mechanismus des langlebigen Lernens oder der Erinnerungen.
Man gibt zu, dass es von philosophischer Bedeutung ist, aber im Grunde genommen arbeitet keiner daran.
Zuletzt noch: anonyme Finanzierung und Veröffentlichungen sind immer schwer zu bekommen.
Während andere einem glücklich über die zehn Milliarden Dollar erzählen,
die sie für ihr Experiment ausgegeben haben, haben wir Schwierigkeiten.
Die Möglichkeit existiert noch, dass ich senil werde, wie es anderen Preisträgern passiert ist.
Genießen Sie also alles in Lindau mit Vorsicht.
Vielen Dank.
