Thank you.
As indeed was said I am going to talk about membrane proteins.
You will see lots of membrane protein structures but I should make clear from the very beginning
that we don’t do membrane protein structures in order to see how the structures look like.
We would like to know how these machines work.
And for this we have to know what the structure is.
And this will then form the basis to understand the mechanism of action of these molecular machines.
And I should say that membrane proteins in general perform many important roles.
But the major problem is that we cannot study them in great detail because we don’t have much membrane protein,
much of the membrane protein available from the amount.
And also they are very difficult to handle and we have still a severe lack of knowledge about membrane proteins.
Membrane proteins constitute about 40% of all proteins of your body.
But we know at present about 20 membrane protein structures from 12 different proteins.
And we know about maybe 5,000, 7,000 water soluble proteins.
And this tells you where the challenges are.
And the challenges in membrane proteins are primarily crystallisation.
Crystallography is a method, we have many different methods.
And one of the points of my lecture will be that you need many different methods nowadays in order to solve biological problems.
And the first slide, I show you the biogenic system from purple bacteria, which is a form of photosynthesis.
And we have here in the heart, the blue machine here is a photosynthetic reaction centre
and that’s the one we were awarded the Nobel Prize in 1998.
And the next, this actually, this machine gets the energy from the light harvesting complexes.
You see here this one in pink, which surrounds the whole reaction centre and actually there are more light harvesting complexes
which are in the membrane which transfer the energy from a light harvesting complex 2 to light harvesting complex 1
to the reaction centre where we get electron transfer.
I will only shortly touch the reaction centre.
The role of the reaction centre is to transfer electrons from a primary electron donor here across the membrane
towards acceptor molecules which are quinones, here we’ve a QB
and we have to transfer a second electron to get a double protonation.
We have the hydronium ion diffuses towards, in the membrane towards the cytochrome BC1 complex,
gets oxides there and the protons are transported across the membrane in this complex.
And the electrons end up in cytochrome C2, diffuse spec, in the periplasmic space of the bacterium
and reduce the primary electron donor again via bound heme groups.
So we have a cyclic flow of electrons.
And the purpose for that cyclic flow of electrons is to pump protons in the cytochrome BC1 complex across the membrane.
And we will hear more about the cytochrome BC1 complex in the following talk given by Hans Deisenhofer.
And the cytochrome BC1 complex also plays a very important role in respiration and you will see this complex in a similar scheme.
The electrochemical proton gradient consisting of an electric field which is the more important component
and the proton gradient drives proton spec through the membrane.
And it’s now clear from the work of Paul Boyer who presented that part yesterday and John Walker and his colleagues in Cambridge,
that you have here this water soluble complex for which they determined the structure.
That the gamma subunit here rotates and the backflow of protons here drives the rotation of the gamma subunit.
And per one rotation of the gamma subunit you get one ATP formed from ADP and phosphate.
ATP is the general currency of life, you could call it the Euro of life.
So we have already a unified energy currency in biology, we will have it in Europe, maybe in the world at the end also.
Now I start with the light harvesting complex.
You see here the structure of a light harvesting complex determined by us recently in Frankfurt.
And you see here in green chlorophyll molecules.
We have two rows of chlorophyll molecules in overall.
There are 8 chlorophylls in this complex, there are 16 of this type up here and they are actually, they are linked,
they are bridged by carotenoid molecules.
Carotenoids are very important molecules in life.
First, they have a photoprotective function.
And they prevent the damaging effect of activated oxygen species.
And also they quench triplet states of chlorophylls which could generate such excited oxygen molecules.
And second, they absorb light and they transfer the energy to the chlorophylls and the chlorophylls then transfer the energy
to the next light harvesting complex and then to the reaction centre where some work is done.
This here is the same complex viewed from the top on to the membrane.
You see here 2 helical membrane proteins.
This is the so called alpha subunit, this is the beta subunit.
And in between we have in green the chlorophylls, one circle and another chlorophyll we have here.
And you see again here the carotenoids with their double role.
And this kind of circular arrangement is quite remarkable and maybe nature invented some kind of synchrotron before man did it.
So nature maybe is always first.
And how the whole structure is arranged in the membrane, photosynthetic membrane is in here.
We have here the light harvesting complex 2.
That’s the light harvesting complex 1 which surrounds the reaction centre.
You see here in yellow the reaction centre.
And the energy, only the energy is transferred from here to the next and from here to the primary donor of the reaction centre.
You see the respective chlorophylls here vaguely in red and there you get electron transfer.
And electron transfer then is chemistry.
We start off with first light absorption, energy transfer and then electron transfer which is chemistry.
And at the end we generate ATP, the ATP is used to fix carbon dioxide, to synthesise carbohydrates in the dark reaction.
And this is the food where we all live from.
And of course we eat the food, we degrade food and at the end we have the citric acid cycle, we have glycolysis.
And we end up in the splitting of our food stuff into hydrogen,
in some biological form of hydrogen which is then converted further.
And this is done in the respiratory chain.
And the respiratory chain is shown on this slide.
You see here the respiratory chain of a bacterium called paracoccus denitrificans, which is quite well studied.
It has the advantage that you can use genetic methods in order to study the role of these components.
And also it appears to be closely related to the ancestor of your own mitochondria.
And everything what I tell you here is also valid for your own mitochondria in your own body.
First you generate NADH, in the cyclic acid cycle.
And this is the bound form of hydrogen in biology.
And what the respiratory chain does, it converts it with oxygen to form water.
And it has developed a quite complicated machinery.
Not only to prevent that you have a detonating gas reaction to prevent explosions in your body all over and the loss of energy.
And also we like to make use of the energy and the principle is the same as in photosynthesis.
We have here four complexes, NADH is first oxidised here in this complex called complex 1.
And protons are translocated across the membrane in addition to some electrons, to reduction of quinone molecules.
So we reduce quinone molecules in the reaction centre.
Complex 1 does the same.
The hydroquinone diffuses in the membrane towards the cytochrome BC1 complex.
And we will hear all the details of that complex in the subsequent talk.
Electrons there are transferred towards cytochrome C, cytochrome C diffuses towards cytochrome C oxidase, this is this complex.
And this complex is of particular interest because it is the one where oxygen is reduced, water is formed.
And here we have some kind of vectorial reaction.
These kind of vectorial reactions were first described by Peter Mitchell in his so called chemiosmotic hypothesis
for which he was awarded the Nobel Prize too.
And this is a very important concept and it was very tough to get the concept brought through and he fought about 20 years.
And I think that Boyer yesterday had a slide where he showed you the rate of acceptance of his hypothesis among his colleagues.
But I think now nearly everybody accepts it.
And cytochrome C oxidase there is the terminal enzyme.
So electrons from cytochrome C are transferred to a binuclear copper A centre.
So we have here some inorganic chemistry going on, reduction of two copper atoms.
Electrons are transferred further to a first heme A molecule.
Heme A which is in this case called simply heme A.
And the electron further transferred to a second heme A which is now called heme A3, for historical reasons.
And pretty near the heme A3 iron we have a copper B bond and the active site,
the business unit here is between the iron and the copper B.
That’s the place where oxygen is found, where electron reduced the oxygen, where protons are taken up.
Protons are taken up exclusively from the inside and water is formed.
So we get creation of an electric field by having the electrons from the outside and the protons from the inside.
And in addition nature has invented a trick to transport the same amount of protons
as there are consumed by water formation across the membrane.
And this doubles the energy yield in our cytochrome C oxidase.
The consequences of course that you need only half of the food in order to get the same amount of ATP at the end.
Nowadays of course in Europe we have the opposite problem.
And there certainly are people which would like to switch off the proton pump
in order to have less efficient energy conversion and to fight obesity in the body.
But certainly this is not the approach, not the goal of our research to abolish the proton pump in cytochrome C oxidase.
We tried again the method of crystallography to get the structural information
which we need to understand the mechanism of this enzyme at the end.
So we tried again to crystallise it, isolating this complex first from the membrane in the form of detergent micelles
and trying to crystallise.
This didn’t work from the beginning and we used another trick.
We used monoclonal antibodies.
So we used methods from immunology in order to get crystals.
We used methods from gene technology to produce crystals.
We produced monoclonal antibodies first, which means we take a mouse, immunise it with this complex,
the mouse develops antibodies against the cytochrome C oxidase.
We sacrifice the mouse, take the spleen cells, fuse them with cancer cell lines.
Get a hybridomas cell lines which produces antibodies against the cytochrome C oxidase.
Then we continue, isolate the genes for these antibodies and express these genes in bacterium E coli.
Then we go on in our stuff, make the complex of cytochrome C oxidase in the part of the antibody fragment
and crystallise this complex.
These are now the crystals.
They have a length of about 1 millimetre, diameter is about 0.3.
Then we use crystallography and the most important point when you get crystals is that they should diffract electrons well.
The diffraction here was I would say, was motivated best, you see here diffraction.
Taking a synchrotron and the synchrotron actually was in Japan, in Tsukuba.
And this synchrotron was particularly helpful because it had a mode of data collection which could be used
for less well diffracting crystals and also for adjacent sensitive crystals, much better than the European ones.
And the diffraction limit here is about 2.8 angstrom but perpendicular to it,
it’s only about 4 angstrom which is just the limit of getting a protein structure.
Nevertheless you see here now this structure of the entire complex.
So this is the cytochrome C oxidase.
This is the antibody fragment which we used for getting the crystals.
It helps to form the crystal lattice and without this addition to watch the cytochrome C oxidase,
we would not get crystals because most of the protein here is actually buried in a detergent micelle.
And in a detergent micelle this part of the protein is not available for crystallisation.
So this is why we had to use this antibody fragment.
And we tried it also with a PC1 complex, it worked well and at present the method, we have a 100% success rate.
And I hope that we will be able to determine more membrane protein structure in the near future.
And I hope you can hear about more membrane proteins 3 years from now in the same chemistry symposium here.
Here you see here in purple, subunit 2, you barely can see here carbon atoms bound to the protein.
You can see here innovate now a heme A which is bound towards the yellow subunit 1.
You see here heme A3 and here is the copper B.
So electron transfer is restricted to this rather narrow part here.
Cytochrome C binds towards this corner of the enzyme and transfers the electron towards here
and then the electron is transferred here and then here.
Protons are taken up from the inside.
And protons are pumped across the membrane and it is of great interest to understand
how the transfer of electrons and protons are coupled.
What's also of particular interest is the distribution of amino acid residues.
And I show you here the distribution of both residues which are frequently charged in nature.
Of course argenine and lysine can be positively charged, aspartic acid and glutamic acid can be negatively charged.
And we have only very few in the hydrophobic environment of the membrane.
And they are there for either structural or functional reasons, these are there for structural reasons.
This is, we don’t know it yet for structural reason.
This is here a glutamic acid residue and when you change this by genetic methods, so you have to use genetic methods,
site directed mutagenesis to change it, even to a glutamine which is a rather minor change.
The enzyme is dead, it doesn’t work.
And this is therefore of great importance.
There is another residue of great importance which is this lysine here in blue.
And if you change this to a neutral residue, you get the same phenotype, the enzyme is dead, it doesn’t function.
And we presume that these residues are involved in proton transfer towards the active site.
And this may be also involved in transferring those protons which are transported across the membrane.
And I will also discuss some more residues later on.
I simply, and I will describe individual protein subunits.
We have here subunit 3, subunit 3 has an open V-shape arrangement.
We have two transmembrane alpha helices here, we have here five transmembrane alpha helices.
And we have some bound lipid molecules here in the cleft.
And the role of subunit 3 is not well understood.
There are two suggestions, first you can delete the gene in our bacterium
and what you get is you get a reduced amount of cytochrome C oxidase consisting of two subunits.
This 2 subunit cytochrome C oxidase is still active in proton pumping and in the turnover of the enzymes.
So it can have nothing to do, the subunit with proton pumping or with the oxygen reduction.
We think actually that this subunit has some role in oxygen diffusion and I will talk about this point later on a little bit.
Here I show you subunit 2, subunit 2 has an N terminus up here.
Here it goes to the C terminus and we have an irregular protein fold.
Then we have two membranes spanning helices.
Then we have two here, the kind of protein fold which was already known, it corresponds to that of the type 1 copper proteins.
And here there are some differences.
Primarily we have here, we have two copper atoms.
You see them here at the tip together with the mode of binding.
I don’t go into further details, due to the time limits.
And why we have here two instead only of one copper atoms, is not well understood.
It might be due to the reorganization energy and what this actually is, probably we will hear tomorrow by Rudi Marcus.
And he would develop a theory of electron transfer and the reorganization energy is certainly an important parameter
and might be the reason why we here have two and not only one copper atom.
This is here subunit 1.
Subunit 1 has a rather regular appearance, looks like a cylinder consisting of 12 transmembrane helices.
And in here we have the binding site of the porphyrin rings, the hemes, we have here the heme A3.
And quite interesting, the hydrophobic tail here is bent away and this allows the access of protons towards the active site here.
And I will discuss this point also further.
And here you see subunit 1 now from the top and this is actually the most interesting view.
You see the 12 transmembrane helices, they are all tilted.
They are rather long, much longer than was expected.
Here we have helix number 1, the brown one, number 2 is the green one, number 3 the blue, 4 is purple, 5 is the red,
this red one is 6, they continue like this with counting.
It’s a sequential simple topology, sequential arrangement of helices.
However 4 helices each in projection form a half circle.
So here we have one half circle, here we have another half circle and here we have the third half circle.
And in this kind of arrangement you generate three pores.
So we have here some kind of pore.
And we think that this pore is used for proton transfer to the centre of the membrane.
And then the proton is diverted towards the active site.
Here we have the second pore and this pore is used for proton access towards the active site partly,
controlled proton access to the active site.
And then the pore is blocked by the heme A3 which is seen edge on.
Here you see the copper B nearby.
And here is the place where the oxygen is bound.
And the tail here is bent away again, as I mentioned already in order to allow access of protons towards this place.
Here we have the third pore and this appears to be tightly blocked by the heme A which is the first electron acceptor
which transfers the electron towards this other heme.
The entire cytochrone C oxidase can be seen here from the periplasmic space.
Again in a simplified truncated version.
Subunit 1 in yellow, subunit 2 in blue, together with a beta-strand (in red) rich area.
And you can see here this part covering here additionally the heme A 3 and the copper B which is in this position.
And you see also very nicely here subunit 3.
And what we actually think is, we have here identified a hydrophobic channel from the binding site of the lipids
towards the active site here.
And we think that this channel actually is used for the diffusion of oxygen towards the active site.
And you are probably not aware of the fact that oxygen is a hydrophobic entity.
It likes to be enriched in membranes and you know from spectroscopy that it is enriched in the membrane by a factor of 7.
And therefore it’s very likely and it makes good sense
if we have oxygen diffusion from the lipidic milieu from the membrane towards selective site.
And if we here have loosely bound lipid molecules, we are able probably to enrich oxygen here further.
So this may be an oxygen trap and the oxygen then can diffuse from this oxygen pool towards the active site.
Here you see more details of this oxygen diffusion channel, of this presumed oxygen diffusion channel I should say.
You see primarily hydrophobic residues, phenyl rings, lining up, tryptophan residues.
And at the end you here have valine.
Here we have the binding site for the copper B together with a ligand.
Here we have the heme A3.
And it is known from spectroscopy that when oxygen diffuses in, it first becomes temporarily bound towards copper B
and then it is transferred to the heme A3.
It also makes sense from the channel structure.
And site directed mutagenesis, genetic method has shown that when you change this valine to the slightly larger isoleucine,
you get a reduction of the diffusion speed which means that the KM value for the enzyme for oxygen is increased by a factor of 10.
But maximum to an over number of the enzyme is still the same if you simply have a 10 fold higher oxygen concentration.
So this makes sense with the assignment of this channel to an oxygen diffusion channel.
Now I come towards the most complicated thing in my talk.
This is the environment of the binding site of the heme A3.
You see the heme A3 light blue together with the protein.
The heme groups have two propionate side chains.
So here we have one propionate side chain and this is charged, neutralised by forming an iron pair with an arginene here.
We have the second propionate here and this is not charged, neutralised.
The charge there gets stabilised by accepting hydrogen bonds from neighbouring residues here.
Quite interestingly, we also had from the very beginning, we could identify the copper B down here.
And from site directed mutagenesis work it has been known that there are mostly like three histidine ligands.
But we could only identify two histidine ligands and the other one, for the third one we had no electron density at all.
And there had been the proposal in the literature that a histidine might change its protonation stage
during the term of the enzyme being negatively charged meaning imidazolate form in one state of the enzyme
becoming imidazole and imidazolium.
The positively charged form in the enzyme and the imidazolium form cannot be ligand to copper B.
So the histidine could shuttle between two positions depending on the portonation state.
And it could carry over protons by switching between the two positions and this might be the mechanism of how a proton pump works.
But this I have to say is speculation and there is at present no evidence for that.
And when we repeated the whole experiment in the absence of azide with the oxidised and reduced forms,
we could not discover the absence of the histidine ligand.
We could clearly see the ligand of the histidine as being still a ligand to copper B.
And it stays there upon oxidation and reduction of the enzyme.
And then we think that the absence of the histidine ligand was an artefact due to the presence of azide.
So you have to be pretty careful.
As I mentioned we had some problems with our original crystal form and a graduate student in the lab Christian Ostermeier
who also had made the first crystal form, worked very hard to get better crystals.
He succeeded now with the 2 subunit form of the enzyme, only two proteins of unit presence, he got these crystals.
They don’t look as nice as the other ones, the protein is pretty unhappy,
you see some denature protein under the crystallisation conditions, but the crystals are much bigger than our first version.
So we could determine an improved structure and the improvement was largely,
we had a much better definition of the position of the atoms and we could start to identify bound to water molecules.
And each of these green balls means the position of a water molecule.
And much to my surprise you see many water molecules up in the upper half of the enzyme but only very few below them.
Which probably means that we have also water molecules here but they are much less ordered
whereas the water molecules here are much better ordered, much more highly ordered.
And this could have some functional significance.
This here, coming back to mechanism, shows you the electron density of the copper B, this is the copper B electron density.
And this is the missing electron density for histidine ligand.
And this could be interpreted in the form of a mechanism of proton pumping
when you consider that actually you have an iron atom here, a copper B atom, the iron has a formal charge of +3, the copper of +2.
And most likely you have an OH-, a hydroxyl group between both atoms
cannot be resourced by x-ray crystallography at our resolution.
But there is spectroscopic evidence for that.
And I think also otherwise if you would have only the positive charges here, you would get a too strong electrostatic repulsion,
the distance is only about 5 angstrom.
And the whole thing nearly would explode if you wouldn’t have a negative charge between both atoms.
So the OH here makes good sense.
The basic idea however in this histidine cycle mechanism is when you start from the oxidised form of the enzyme,
you get reduction of the enzyme from the periplasmic place.
The electron is transferred first to the iron, then it hops over, jumps over on to the copper.
And this then disturbs the charge balance in the whole environment.
And in order to regain the charge balance, you take up a proton, very simply.
And this then converts upon the first reduction, this copper B, this ligand from the imidazolate to the imidazole.
Then you take up the second electron which stays on the iron.
You neutralise this additional charge by taking up a proton.
You convert this ligand to the imidazolium form and the imidazolium can no longer be a copper B ligand
and it flips over in this position.
Then you bind oxygen, this is known that only after full reduction you bind oxygen here.
And then the chemistry, the oxygen starts.
You get uptake of protons to form the first water molecule.
When you take up protons you disturb again the charge environment
and the charge of the protons then expels these two protons up here.
And so the uptake of the two protons to form water would expel the protons already here
in order to have the same charge environment.
And this hypothesis I think is the most simple one for explaining a pump mechanism
but it certainly cannot be phrased in the term of a histidine cycle and we have to think of alternatives.
This is now the electron density for the oxidised and reduced form.
And in the histidine cycle, in the reduced form we should not have all the histidine ligands present.
They are there and this I think is one of the fundamental experiments
which tells you that the histidine cycle mechanism is unlikely.
In addition I have great problems to see how a positively charged histidine would not deliver back its proton
towards a reduced oxygen species at the binuclear site.
Now I show you some more interesting new details.
Again it’s the heart of the enzyme.
You see here an unbiased electron density map, calculated by a technique called simulated annealing omit map,
you omit from the model all these residues and start to, and do simulate annealing to get a way of bias, use the new phases,
calculate an unbiased electron density map and this is this electron density here and you rebuild the model.
You see here the model of the heme A3, this is the iron, it’s a histidine ligand to the iron.
You see here the copper B and you see here the histidine ligands towards copper B.
This is the third one and much to the general surprise what you find is
that a nearby tyrosine is covalently crosslinked with the histidine.
So we have here an unexpected covalent crosslink.
And of course this kind of thing, these modifications cannot be discovered from DNA sequences.
You still have to do some further experiment apart from DNA sequencing.
And there is some meaning about this and I would think that the principle meaning is
that you get such a high oxidative power during the reaction that it extracts an electron from the environment.
You generate a radical and it’s known that tyrosine can form this kind of radicals.
And then in a radical mechanism you simply, you get this kind of crosslink.
And such kind of cross links also have been observed, not with histidines
but with for instance cysteines and other residues in peroxidases.
So peroxidase in general have enough oxidative power to generate radicals which then leads to crosslinks in proteins.
And this means we can have the same type of reaction here.
Now I think it becomes more systematic.
This is now the catalytic cycle of cytochromes C oxidase.
And this is simple, we start off with oxygen, the iron is in +3 form, copper +2.
When we put on the first electron which goes on to the copper, converting one to copper 1
and this is known that this is accompanied by the uptake of a proton, this is the one electron reduced form,
take up the second electron accompanied by the uptake of a proton, you get the reduced form iron +2, copper +1.
Then you take up the oxygen only and you get formation of the so called compound A,
which was discovered by Britton Chance in Philadelphia more than about 20 years ago.
And then you form a compound called P, P was for a long time thought to be a peroxy compound.
At least a former peroxy compound, iron +3, copper +2, but the electrons from the metals are transferred onto the oxygen.
I always considered this as a very unlikely structure and I wondered how this could be stable.
And actually my scepticism was, I should say was satisfied by recent experiment in Japan by Kitagawa,
who by resonance in spectroscopy got clear cut evidence that you actually have already in the P state split oxygen compound.
And you have actually oxo-ferryl.
This means an oxygen bound to the iron in a double bonded way, iron +4, oxygen -2 in this form and you have the copper +2.
But this would then mean that you miss an electron here.
And this compound has to steal an electron.
And the possibilities are that it’s stolen, the electron is stolen from the porphyrin,
it’s stolen from the residue and the tyrosine is a good explanation.
People discuss also that the copper might become copper +3.
And also people discuss that the iron might be +5.
But these are all less likely than this explanation where you steal the electron from a tyrosine creating a tyrosine radical.
But this is under debate but I think that this root became much less likely within the last year.
So this is a rather new experiment.
The major problem that we then have is however that it is known primarily from Wikström’s work in Helsinki
that the proton pumping is of course only in the transition from the P state to the F state.
This state here is well characterised and everybody agrees that this is oxo-ferryl state here.
And it’s also known that the next two protons are pumped in the conversion, in that way of conversion.
And if we have this kind of mechanism we might, we should have observed proton pumping already
and we have to think about a way out if we don’t have formation of water molecules and the incoming protons expel the protons
which had been taken up during reduction at that time.
So now I just want to come back towards the structure.
You see here in red together with the histidine ligands, the heme A, this is the heme A3.
And the point I want to discuss is where do the protons go which are taken up upon reduction?
I think actually that the protons which are taken up are stored on the propionates in this area up here.
And there appears to be a rapid equilibration of protons in that area.
And later you get uptake of the protons and I have formulated a mechanism
which I think would be in agreement with all kind of mechanisms.
Actually they are in the protein which I didn’t say so far, they are the two identifiable proton transfer pathways,
this one with lycene involved and this one here which has an aspartic acid at the beginning and a glutamic acid at the end.
And I think that the protons are delivered from this glutamic acid on to the propionates towards this area during the pumping.
And when electrons come in towards forming the oxygen,
they are then expelled from that area to the outside, this would explain pumping.
But I cannot go further into details in order to explain that cycle.
And I would take too long now to explain these details and you have to contact me privately in order to discuss it further.
But just to say, we need different methods in order to prove this and what we did now,
we made a biosynthetic deficient mutant for heme A and fed isotopically labelled precursors in a way
that only these carbon atoms are labelled with 13C of the heme A and did Fourier transform infrared spectroscopy.
So we now use even another method and we look what changes in the vibrational bands upon reduction.
And you see this for labelled and unlabeled, you see the differences for labelled and unlabeled cytochrome C oxidase.
And there are clear differences which tell you that there are changes of protonation states
and conformation of the propionates upon reduction.
And this at the end can be summarised in some kind of mechanism which purely operates on electrostatic grounds.
And this is now our working hypothesis and we work very hard either to prove or disprove such kind of mechanism in detail.
But at least you get an idea.
The whole thing is complicated.
And still we have to get an idea, we have to go into details and we need all the methods.
And I think the message for you is, for the students is, that you have to know all the methods
in order to use them efficiently to solve biological problems.
And the people at the end I would like to acknowledge are here from my own group,
Gerald Kleymann establishing the method of the antibody fragment production in the lab.
Christian Ostermeier did most of the crystallisation work and also determined the second crystal structure.
Hanni Müller isolated most of the material, So Iwata isolated in a very, sorry solved the protein structure in a very short time.
Axel Harrenga then improved his structure and got now a much better structure.
Aimo Kannt did electro study calculations which, theoretical calculations which I didn’t mention.
And Julia Behr is involved in this Fourier transform infrared study
together with Werner Mäntele and Petra Hellwig from the University of Munich.
Some mutant work was done at Frankfurt University by our biochemical collaborator Bernd Ludwig and Heike Witt.
Now I thank you for your attention.
Vielen Dank.
Ich werde in der Tat wie angekündigt über Membranproteine sprechen.
Sie werden viele Membranproteinstrukturen sehen, ich möchte aber von Anfang an klarstellen,
dass wir uns nicht damit beschäftigten, um das Aussehen der Strukturen herauszufinden – wir möchten vielmehr wissen,
wie diese Komplexe funktionieren.
Zu diesem Zweck müssen wir die Struktur kennen.
Das ist die Basis für das Verständnis des Wirkmechanismus dieser molekularen Maschinen.
Es ist anzumerken, dass Membranproteine im Allgemeinen viele wichtige Funktionen haben.
Das Hauptproblem ist jedoch, dass wir sie nicht genau untersuchen können,
weil uns Membranproteine nur in kleinen Mengen zur Verfügung stehen.
Außerdem sind diese Proteine äußerst schwer zu handhaben, und wir wissen immer noch viel zu wenig über sie.
Membranproteine machen etwa 40% aller Proteine im Körper aus.
Derzeit kennen wir aber nur etwa 20 Membranproteinstrukturen aus 12 unterschiedlichen Proteinen
sowie etwa 5000, 7000 wasserlösliche Proteine.
Sie sehen also, wo hier die Herausforderungen liegen.
Die wichtigste Herausforderung stellt die Kristallisation dar.
Die Kristallographie ist eine Methode; wir haben zahlreiche unterschiedliche Methoden.
Zur Lösung biologischer Probleme sind heutzutage viele verschiedene Methoden erforderlich –
das ist einer der Punkte, die ich Ihnen mit meinem Vortrag verdeutlichen möchte.
Auf dem ersten Dia sehen Sie das biogene System von Purpurbakterien, eine Art Photosynthese.
Hier in der Mitte, diese blaue Maschine ist ein photosynthetisches Reaktionszentrum,
für das wir 1988 den Nobelpreis bekommen haben.
Diese Maschine hier empfängt Energie aus den Lichtsammelkomplexen.
Sie sehen hier diesen rosa dargestellten Komplex, der das gesamte Reaktionszentrum umgibt.
Es gibt noch mehr Lichtsammelkomplexe in der Membran,
die die Energie von Lichtsammelkomplex 2 zu Lichtsammelkomplex 1 zum Reaktionszentrum übertragen,
wo der Elektronentransfer stattfindet.
Ich möchte das Reaktionszentrum nur kurz anschneiden.
Die Rolle des Reaktionszentrums ist die Übertragung von Elektronen von einem primären Elektronendonator
durch die Membran auf Akzeptormoleküle, so genannte Chinone, hier mit QB bezeichnet.
Für eine doppelte Protonierung muss ein zweites Elektron übertragen werden.
Es entsteht Hydrochinon, das in der Membran zum Cytochrom BC1-Komplex diffundiert und dort oxidiert wird;
die Protonen werden durch die Membran in diesen Komplex transportiert.
Die Elektronen landen schließlich im Cytochrom C2, diffundieren zurück in den periplasmatischen Raum des Bakteriums
und reduzieren den primären Elektronendonator erneut über gebundene Hämgruppen.
Wir haben also einen zyklischen Elektronenfluss, dessen Zweck es ist,
Protonen im Cytochrom BC1-Komplex durch die Membran zu pumpen.
Sie werden im nachfolgenden Vortrag von Hans Deisenhofer noch mehr über den Cytochrom BC1-Komplex hören.
Der Cytochrom BC1-Komplex spielt auch eine sehr wichtige Rolle bei der Atmung;
dieser Komplex wird Ihnen in einer ähnlichen Darstellung wiederbegegnen.
Der elektrochemische Protonengradient besteht aus einem elektrischen Feld,
einer recht wichtigen Komponente, und treibt den Protonenrückfluss durch die Membran an.
Dank der Arbeit von Paul Boyer, der diesen Teil gestern vorgestellt hat, und John Walker et al.
in Cambridge steht heute fest, dass wir hier diesen wasserlöslichen Komplex haben –
dessen Struktur von diesen Wissenschaftlern bestimmt wurde – die Gamma-Untereinheit rotiert
und der Protonenrückfluss die Rotation der Gamma-Untereinheit antreibt.
Mit jeder Rotation der Gamma-Untereinheit entsteht aus ADP und Phosphate ein ATP.
Bei ATP handelt es sich um die universelle Währung des Lebens, sozusagen den Euro des Lebens.
Wir haben also bereits eine einheitliche Energiewährung in der Biologie;
wir werden eine solche einheitliche Währung auch in Europa und vielleicht sogar einmal auf der ganzen Welt haben.
Ich beginne jetzt mit dem Lichtsammelkomplex.
Sie sehen hier die Struktur eines kürzlich von uns in Frankfurt bestimmten Lichtsammelkomplexes.
Hier sind die grünen Chlorophyllmoleküle.
Insgesamt gibt es zwei Reihen von Chlorophyllmolekülen.
In diesem Komplex sind 8 Chlorophylle, hier oben befinden sich 16 dieses Typs.
Sie sind durch Carotenoidmoleküle verbunden.
Carotenoide sind ausnehmend wichtige Moleküle des Lebens.
Zunächst haben sie eine Lichtschutzfunktion.
Außerdem verhindern sie schädigende Auswirkungen aktivierter Sauerstoffspezies sowie Triplettzustände des Chlorophylls,
die zur Entstehung dieser angeregten Sauerstoffmoleküle führen können.
Zweitens absorbieren sie Licht und übertragen die Energie auf das Chlorophyll,
welches die Energie dann auf den nächsten Lichtsammelkomplex und anschließend auf das Reaktionszentrum überträgt,
wo Arbeit verrichtet wird.
Hier sehen Sie denselben Komplex mit Blick von oben auf die Membran.
Sie erkennen zwei spiralförmige Membranproteine; hier die so genannte Alpha-Untereinheit, hier die Beta-Untereinheit.
Dazwischen befinden sich grün dargestellt die Chlorophylle, ein Kreis hier und noch ein Chlorophyll dort.
Auch hier sind die Carotenoide in ihrer Doppelfunktion erkennbar.
Diese zirkuläre Anordnung ist ziemlich bemerkenswert;
vielleicht hat die Natur schon vor dem Menschen eine Art Synchrotron erfunden.
Vermutlich hat die Natur immer die Nase vorn.
Wie ist die ganze Struktur also in der photosynthetischen Membran angeordnet?
Wir haben hier den Lichtsammelkomplex 2, das ist der Lichtsammelkomplex 1, der das Reaktionszentrum umgibt,
das hier gelb dargestellt ist.
Die Energie, und zwar ausschließlich die Energie wird von hier zum nächsten
und von dort zum primären Donator des Reaktionszentrums übertragen.
Die jeweiligen Chlorophylle sind leicht rötlich dargestellt; hier findet der Elektronentransfer statt.
Elektronentransfer ist Chemie.
Es beginnt mit der ersten Lichtabsorption, dann erfolgen der Energietransfer und schließlich der Elektronentransfer, also Chemie.
Am Ende entsteht ATP.
Das ATP dient der Fixierung von Kohlendioxid und der Synthese von Kohlehydraten in der Dunkelreaktion.
Das ist der Stoff, von dem wir alle leben.
Wir nehmen Nahrung zu uns und bauen sie ab; am Ende steht der Zitronensäurezyklus, die Glycolyse.
Unsere Nahrung wird in eine biologische Form von Wasserstoff aufgespalten, die dann weiter umgewandelt wird.
Dies erfolgt in der Atmungskette; sie ist auf diesem Dia dargestellt.
Sie sehen hier die Atmungskette eines gut erforschten Bakteriums namens Paracoccus denitrificans.
Der Vorteil besteht darin, dass man die Funktion dieser Komponenten anhand genetischer Methoden erforschen kann.
Zudem scheint eine nahe Verwandtschaft mit dem Vorgänger unserer eigenen Mitochondrien zu bestehen.
Alles, was ich Ihnen erzähle, gilt auch für die Mitochondrien in unserem eigenen Körper.
Zunächst wird im Zitronensäurezyklus NADH, die gebundene Form von Wasserstoff in der Biologie gebildet.
In der Atmungskette wird er mit Sauerstoff in Wasser umgewandelt.
Es hat sich eine relativ komplizierte Maschinerie entwickelt, die nicht nur eine detonierende Gasreaktion,
sondern Explosionen im ganzen Körper sowie einen Energieverlust verhindert.
Wir machen uns die Energie zunutze; das Prinzip ist dasselbe wie bei der Photosynthese.
Sie erkennen hier vier Komplexe.
Zunächst wird NADH in diesem als Komplex 1 bezeichneten Komplex oxidiert.
Neben einigen Elektronen werden zur Reduktion der Chinonmoleküle Protonen durch die Membran transloziert.
Die Chinonmoleküle werden also im Reaktionszentrum reduziert.
Komplex 1 tut dasselbe.
Das Hydrochinon in der Membran diffundiert zum Cytochrom BC1-Komplex.
Nähere Einzelheiten zu diesem Komplex erfahren wir im nachfolgenden Vortrag.
Die Elektronen werden auf das Cytochrom C übertragen, welches zur Cytochrom C-Oxidase, diesem Komplex hier, diffundiert.
Dieser Komplex ist von besonderem Interesse, denn dort wird der Sauerstoff reduziert und es entsteht Wasser.
Wir haben hier eine Art Vektorreaktion.
Solche Reaktionen wurden erstmals von Peter Mitchell in seiner so genannten chemiosmotischen Hypothese beschrieben,
für die er den Nobelpreis erhielt.
Das ist ein sehr bedeutendes Konzept, das sich nur schwer durchsetzen ließ; er kämpfte gut 20 Jahre dafür.
Ich glaube, Boyer hat gestern ein Dia gezeigt, das die Akzeptanz dieser Hypothese seitens seiner Kollegen darstellte.
Heute ist sie aber, soweit ich weiß, allgemein anerkannt.
Die Cytochrom C-Oxidase stellt das letzte Enzym dar.
Die Elektronen werden vom Cytochrom C auf ein binukleares Kupfer A-Zentrum übertragen.
Hier findet also eine anorganische Reaktion statt, nämlich die Reduktion zweier Kupferatome.
Die Elektronen werden weiter auf ein erstes Häm A-Molekül übertragen, das hier einfach als Häm A bezeichnet wird,
und anschließend auf ein zweites Häm A, das aus historischen Gründen die Bezeichnung Häm A3 trägt.
Relativ nah am Häm A3-Eisen liegt eine Kupfer B-Bindung;
zwischen dem Eisen und dem Kupfer B befindet sich das aktive Zentrum, der Geschäftsbereich,
in dem Sauerstoff gebunden wird, Elektronen den Sauerstoff reduzieren,
Protonen ausschließlich aus dem Inneren aufgenommen werden und Wasser entsteht.
Durch die Elektronen von außen und die Protonen aus dem Inneren entsteht ein elektrisches Feld.
Zudem hat die Natur einen Trick erfunden, um dieselbe Menge Protonen zu transportieren,
die bei der Wasserbildung durch die Membran verbraucht wurden.
Dadurch wird die Energieausbeute in unserer Cytochrom C-Oxidase verdoppelt.
Die Folge ist natürlich, dass man nur die Hälfte der Nährstoffe benötigt, um letztlich dieselbe Menge ATP zu bilden.
Heute haben wir in Europa das gegenteilige Problem, und es gibt sicherlich Menschen,
die zur Bekämpfung des Übergewichts die Protonenpumpe gerne abschalten würden, damit die Energieumwandlung weniger effizient ist.
Es ist aber sicher nicht das Ziel unserer Forschung, die Protonenpumpe in der Cytochrom C-Oxidase abzuschaffen.
Um die Strukturinformationen zu erhalten, die wir für das letztendliche Verständnis des Mechanismus dieses Enzyms benötigen,
wandten wir erneut das Verfahren der Kristallographie an.
Wir isolierten zunächst diesen Komplex aus der Membran in Form von Tensidmizellen und versuchten ihn zu kristallisieren.
Das funktionierte aber von Anfang an nicht, so dass wir einen anderen Trick anwandten und monoklonale Antikörper einsetzten.
Wir benutzten also Methoden aus der Immunologie und der Gentechnik, um Kristalle zu erhalten.
Zunächst stellten wir monoklonale Antikörper her, d.h. wir immunisierten Mäuse mit diesem Komplex,
die dann Antikörper gegen die Cytochrom C-Oxidase produzierten.
Anschließend wurden die Mäuse getötet und wir entnahmen Milzzellen und fusionierten sie mit Krebszelllinien,
so dass eine Hybridomazelllinie entstand, die Antikörper gegen die Cytochrom C-Oxidase produzierte.
Dann isolierten wir die Gene für diese Antikörper und exprimierten sie im Bakterium E. coli.
Im Anschluss daran stellten wir den Komplex aus Cytochrom C-Oxidase und Antikörperfragment her und kristallisierten ihn.
Hier sehen Sie die Kristalle; sie haben eine Länge von etwa 1 Millimeter und einen Durchmesser von etwa 0,3 Millimeter.
Dann führten wir die Kristallographie durch, wobei das Wichtigste ist, dass man Kristalle mit guter Elektronenbeugung erhält.
Diese Beugung wurde meiner Ansicht nach am besten moderiert; sie stammt aus einem Synchrotron im japanischen Tsukuba.
Dieses Synchrotron war besonders hilfreich, da es über einen Datenerfassungsmodus verfügte,
der sich sowohl bei Kristallen mit weniger guter Elektronenbeugung als auch bei strahlungsempfindlichen Kristallen einsetzen ließ;
eine viel bessere Apparatur als die europäischen.
Die Beugungsgrenze liegt bei 2,8 Angström, senkrecht dazu sind es jedoch nur etwa 4 Angström;
das ist genau die Grenze, wo man noch eine Proteinstruktur erhält.
Gleichwohl sehen Sie nun hier die Struktur des gesamten Komplexes.
Das ist die Cytochrom C-Oxidase, das das Antikörperfragment, mit dessen Hilfe wir die Kristalle hergestellt haben.
Es unterstützt die Kristallgitterbildung; ohne seine Zugabe zur Cytochrom C-Oxidase könnten wir keine Kristalle produzieren,
da der Großteil des Proteins de facto in einer Tensidmizelle eingebettet ist,
in der dieser Teil des Proteins nicht für die Kristallisation zur Verfügung steht.
Daher der Einsatz des Antikörperfragments.
Wir versuchten es darüber hinaus mit einem PC1-Komplex, was gut funktionierte;
aktuell haben wir eine Erfolgsrate von 100%.
Ich hoffe, dass wir in naher Zukunft in der Lage sein werden noch mehr Membranproteinstrukturen zu bestimmen,
und Sie in 3 Jahren in diesem Chemiesymposium von weiteren Membranproteinen hören.
Hier erkennen Sie violett dargestellt Untereinheit 2, wobei kaum Kohlenstoffatome an das Protein gebunden sind.
Sie sehen rot dargestellt ein an die gelbe Untereinheit 1 gebundenes Häm A.
Das hier ist Häm A3, das Kupfer B.
Der Elektronentransfer ist auf diesen relativ schmalen Bereich begrenzt.
Cytochrom C bindet sich an diese Ecke des Enzyms und überträgt die Elektronen hierhin;
anschließend wird das Elektron hierhin und dann hierhin übertragen.
Die Protonen werden aus dem Inneren aufgenommen und durch die Membran gepumpt.
Es ist von großem Interesse zu verstehen, wie der Transfer von Elektronen und Protonen gekoppelt ist.
Die Verteilung der Aminosäurereste ist ebenfalls von besonderem Interesse.
Ich zeige Ihnen die Verteilung der in der Natur häufig geladenen Reste.
Natürlich können Arginin und Lysin positiv, Asparaginsäure und Glutaminsäure negativ geladen sein.
In der hydrophoben Umgebung der Membran finden sich davon nur wenige.
Sie dienen entweder strukturellen oder funktionellen Zwecken; diese hier haben wahrscheinlich einen strukturellen Zweck.
Das ist ein Glutaminsäurerest; verändert man ihn mittels genetischer Verfahren –
man muss selbst bei einer relativ kleinen Veränderung wie der Umwandlung in Glutamin
Verfahren wie die ortsspezifische Mutagenese anwenden – ist das Enzym tot, es funktioniert nicht mehr.
Das ist also sehr wichtig.
Es gibt noch einen anderen Rest von großer Bedeutung, nämlich Lysin, hier blau dargestellt.
Wandelt man ihn in einen neutralen Rest um, entsteht derselbe Phänotyp; das Enzym ist tot, es funktioniert nicht mehr.
Wir gehen davon aus, dass diese Reste am Protonentransfer zum aktiven Zentrum beteiligt sind.
Dieser hier ist möglicherweise zudem an der Übertragung der durch die Membran transportierten Protonen beteiligt.
Ich werde später noch auf andere Reste zu sprechen kommen.
Ich beschreibe nun einzelne Proteinuntereinheiten.
Wir haben hier Untereinheit 3, die eine offene, V-förmige Anordnung besitzt.
Außerdem haben wir hier zwei, dort fünf Transmembran-Alpha-Helices und hier in der Spalte gebundene Lipidmoleküle.
Die Rolle von Untereinheit 3 versteht man noch nicht genau.
Es gibt zwei Überlegungen: Erstens kann man in unserem Bakterium eine Gendeletion vornehmen;
man erhält dann eine kleinere Menge der aus zwei Untereinheiten bestehenden Cytochrom C-Oxidase.
Diese Cytochrom C-Oxidase aus zwei Untereinheiten ist nach wie vor am Mechanismus der Protonenpumpe und dem Enzymumsatz beteiligt.
Untereinheit 3 kann also mit der Protonenpumpe oder der Sauerstoffreduktion nichts zu tun haben.
Wir sind de facto der Ansicht, dass diese Untereinheit bei der Sauerstoffdiffusion eine Rolle spielt;
ich werde später kurz etwas zu diesem Punkt sagen.
Das ist Untereinheit 2 mit einem N-Terminus hier oben und dem C-Terminus; hier erkennen Sie eine unregelmäßige Proteinfalte.
Außerdem gibt es zwei membranübergreifende Helices.
Diese Art von Proteinfalte war bereits bekannt; sie entspricht der der Kupferproteine vom Typ 1.
Hier sehen Sie einige Unterschiede.
In erster Linie haben wir hier zwei Kupferatome; Sie erkennen sie hier an der Spitze zusammen mit dem Bindungsmodus.
Ich werde das aus Zeitgründen nicht weiter vertiefen.
Warum sich hier zwei Kupferatome statt nur einem befinden, versteht man noch nicht genau.
Der Grund könnte die Reorganisationsenergie sein; was das ist, hören wir wahrscheinlich morgen von Rudi Marcus.
Er hat eine Theorie des Elektronentransfers entwickelt,
und die Reorganisationsenergie ist sicherlich ein wichtiger Parameter und könnte der Grund dafür sein,
dass wir es hier mit zwei Kupferatomen statt nur einem zu tun haben.
Das ist Untereinheit 1 mit einem relativ regelmäßigen Äußeren;
sie erinnert an einen aus 12 Transmembranhelices bestehenden Zylinder.
Hier erkennen Sie die Bindungsstelle der Porphyrinringe und die Hämmoleküle, hier Häm A3.
Der hydrophobe Schwanz ist interessanterweise weggebogen und erlaubt so den Protonen den Zugang zum aktiven Zentrum.
Auch diesen Punkt werde ich später genauer diskutieren.
Hier sehen Sie Untereinheit 1 von oben; das ist eigentlich die interessanteste Ansicht.
Sie erkennen die 12 geneigten Transmembranhelices.
Sie sind recht lang, viel länger als erwartet.
Das ist Helix Nummer 1, braun dargestellt, Nummer 2 ist die grüne, Nummer 3 die blaue, Nummer 4 die violette,
Nummer 5 die geknickte rote, Nummer 6 diese rote; die weiteren werden nicht mehr gezählt.
Eine einfache sequentielle Topologie, eine aufeinander folgende Anordnung von Helices.
In Projektion bilden jeweils vier Helices einen Halbkreis.
Wir haben also hier einen Halbkreis, hier noch einen Halbkreis und hier den dritten Halbkreis.
Bei dieser Art von Anordnung entstehen drei Poren.
Wir haben also eine Pore,
die unserer Ansicht nach die Protonen in die Mitte der Membran und von dort zum aktiven Zentrum überträgt.
Hier befindet sich die zweite Pore; sie dient teilweise dem kontrollierten Zugang der Protonen zum aktiven Zentrum.
Die Pore wird durch Häm A3 blockiert, das hochkant dargestellt ist.
Daneben sehen Sie Kupfer B.
An dieser Stelle wird der Sauerstoff gebunden.
Der Schwanz ist auch hier weggebogen, wie ich bereits erwähnte, um den Protonen den Zugang zu dieser Stelle zu ermöglichen.
Hier haben wir die dritte Pore; sie scheint von Häm A, dem ersten Elektronenakzeptor,
der das Elektron auf das andere Häm überträgt, stark blockiert zu sein.
Vom periplasmatischen Raum aus lässt sich die gesamte Cytochrom C-Oxidase überblicken.
Auch hier sehen Sie wieder eine vereinfacht und verkürzt dargestellte Version:
Untereinheit 1 ist gelb dargestellt, Untereinheit 2 blau, zusammen mit einem Betastrang-reichen Abschnitt.
Sie erkennen hier diesen Teil, der zusätzlich Häm A3 und Kupfer B, das sich hier befindet, bedeckt.
Hier sehen Sie sehr schön Untereinheit 3.
Unserer Ansicht nach haben wir tatsächlich einen hydrophoben Kanal von der Bindungsstelle der Lipide
zum aktiven Zentrum identifiziert, der der Sauerstoffdiffusion zum aktiven Zentrum dient.
Ihnen ist wahrscheinlich nicht bekannt, dass Sauerstoff eine hydrophobe Einheit ist,
die sich gerne in Membranen anreichert.
Wir wissen aus der Spektroskopie, dass er sich dort 7-fach anreichert.
Daher ist die Sauerstoffdiffusion vom lipiden Milieu in der Membran zum aktiven Zentrum sehr wahrscheinlich und sinnvoll.
Mit den lose gebundenen Lipidmolekülen kann sich vermutlich weiterer Sauerstoff hier anreichern.
Wir haben es hier also unter Umständen mit einer Sauerstofffalle zu tun;
der Sauerstoff kann von diesem Sauerstoffpool aus zum aktiven Zentrum diffundieren.
Hier sehen Sie weitere Details zu diesem Sauerstoffdiffusionskanal oder besser gesagt vermuteten Sauerstoffdiffusionskanal.
Sie erkennen vor allem hydrophobe Reste, aufgereihte Phenylringe, Tryptophanreste.
Hier am Ende haben wir Valin.
Das ist die Bindungsstelle für Kupfer B zusammen mit einem Liganden.
Hier ist Häm A3.
Wir wissen aus der Spektroskopie, dass Sauerstoff beim Eindiffundieren zunächst vorübergehend an Kupfer B gebunden
und anschließend auf Häm A3 übertragen wird.
Auch im Zusammenhang mit der Kanalstruktur erscheint dies nachvollziehbar.
Das genetische Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese hat gezeigt,
dass die Diffusionsgeschwindigkeit bei Umwandlung von Valin in das etwas größere Isoleucin sinkt,
d.h. der Km-Wert des Enzyms für Sauerstoff um den Faktor 10 zunimmt.
Die maximale Umsatzzahl des Enzyms ist aber bei einer 10-fach erhöhten Sauerstoffkonzentration immer noch dieselbe.
Angesichts der Funktion dieses Kanals als Sauerstoffdiffusionskanal ist das plausibel.
Ich komme jetzt zum kompliziertesten Teil meines Vortrags, nämlich der Umgebung der Bindungsstelle von Häm A3.
Sie sehen hier Häm A3, hellblau dargestellt, zusammen mit dem Protein.
Die Hämgruppen besitzen zwei Propionatseitenketten.
Hier erkennen Sie eine Propionatseitenkette;
sie wird durch Bildung eines Ionenpaares mit einem Arginin geladen bzw. neutralisiert.
Hier ist das zweite Propionat; es wird nicht geladen bzw. neutralisiert.
Die Ladung wird durch Akzeptanz von Wasserstoffbindungen benachbarter Reste stabilisiert.
Interessanterweise konnten wir von Anfang an Kupfer B hier unten identifizieren.
Aus der ortsspezifischen Mutagenese ist bekannt, dass sich dort höchstwahrscheinlich drei Histidinliganden befinden.
Wir konnten aber nur zwei Histidinliganden identifizieren, für den dritten fand sich keinerlei Elektronendichte.
Laut Literatur kann ein Histidin seinen Protonierungszustand während des Enzymumsatzes ändern, was bedeutet,
dass die negativ geladene Imidazolatform in einem Enzymstadium zur positiv geladenen Imidazol- und Imidazoliumform
in einem anderen Enzymstadium wird, wobei die Imidazoliumform kein Kupfer B-Ligand sein kann.
Das Histidin könnte also je nach Protonierungszustand zwischen zwei Positionen pendeln und dabei Protonen transportieren.
Das könnte der Wirkmechanismus der Protonenpumpe sein.
Ich muss allerdings gestehen, dass das Spekulation ist und es aktuell keine Beweise dafür gibt.
Bei Wiederholung des gesamten Experiments mit der oxidierten und reduzierten Form in Abwesenheit von Azid
konnten wir kein Fehlen des Histidinliganden feststellen.
Der Histidinligand war deutlich sichtbar immer noch ein Kupfer B-Ligand
und blieb dort ungeachtet der Oxidation oder Reduktion des Enzyms.
Wir halten das Fehlen des Histidinliganden für ein Artefakt infolge der Anwesenheit von Azid.
Man muss also wirklich vorsichtig sein.
Wie ich bereits erwähnt habe, hatten wir Probleme mit unserer ursprünglichen Kristallform, und einer meiner Doktoranden im Labor,
Christian Ostermeier, der auch die erste Kristallform hergestellt hatte, arbeitete sehr hart an der Gewinnung besserer Kristalle.
Schließlich gelang ihm die Herstellung einer Enzymform mit zwei Untereinheiten, nur zwei Proteinen,
und es entstanden diese Kristalle.
Sie sehen nicht so schön aus wie die anderen – das Protein ist ziemlich mitgenommen,
einige Proteine denaturieren unter Kristallisationsbedingungen – aber die Kristalle sind viel besser als unsere erste Version.
Wir konnten also eine erheblich verbesserte Struktur bestimmen, d.h. die Position der Atome wesentlich besser definieren
und allmählich wassergebundene Moleküle identifizieren.
Diese grünen Kugeln stellen jeweils die Position eines Wassermoleküls dar.
Zu meiner großen Überraschung sieht man bis in die obere Hälfte des Enzyms zahlreiche Wassermoleküle,
darunter aber nur wenige, was wahrscheinlich bedeutet, dass es zwar auch hier Wassermoleküle gibt,
sie aber erheblich weniger geordnet sind, wohingegen die Wassermoleküle hier eine viel höhere Ordnung aufweisen.
Dies könnte von funktioneller Signifikanz sein.
Kommen wir zu dem Mechanismus zurück.
Sie sehen hier die Elektronendichte von Kupfer B; das ist die fehlende Elektronendichte für den Histidinliganden.
Man könnte dies als Mechanismus der Protonenpumpe interpretieren, wenn man bedenkt,
dass sich hier tatsächlich ein Eisenatom und ein Kupfer B-Atom befinden – Eisen hat die formale Ladung +3, Kupfer +2 –
und zwischen den beiden Atomen höchstwahrscheinlich eine Hydroxylgruppe (OH-) liegt,
die sich in der Röntgenkristallographie mit unserer Auflösung nicht darstellen lässt.
Es gibt aber spektroskopische Hinweise darauf.
Auch wenn man nur die positiven Ladungen hier hätte, wäre die elektrostatische Abstoßung meiner Ansicht nach zu stark,
da der Abstand nur etwa 5 Angström beträgt.
Das Ganze würde praktisch explodieren, gäbe es keine negative Ladung zwischen den beiden Atomen.
Das OH ist also sinnvoll hier.
Die diesem Mechanismus des Histidinzyklus zugrunde liegende Idee ist aber Folgende:
Ausgehend von der oxidierten Form des Enzyms wird dieses vom periplasmatischen Raum reduziert.
Das Elektron wird zunächst auf das Eisen übertragen und springt dann auf das Kupfer über.
Dadurch wird das Ladungsgleichgewicht in der gesamten Umgebung durcheinandergebracht.
Um es wiederherzustellen, erfolgt die Aufnahme eines Protons, ganz einfach.
Dieses wandelt bei der ersten Reduktion den Liganden von Imidazolat in Imidazol um.
Dann erfolgt die Aufnahme des zweiten Elektrons, das auf dem Eisen verbleibt.
Diese zusätzliche Ladung wird durch Aufnahme eines Protons neutralisiert.
Dann wird der Ligand in die Imidazoliumform umgewandelt.
Das Imidazolium kann nicht länger als Kupfer B-Ligand fungieren und dreht sich in diese Position.
Dann wird Sauerstoff gebunden, wobei bekannt ist, dass dies lediglich nach einer vollständigen Reduktion erfolgt.
Es werden Protonen aufgenommen, so dass die ersten Wassermoleküle entstehen.
Bei der Aufnahme von Protonen wird die Ladungsumgebung erneut gestört,
und aufgrund der Ladung der Protonen werden diese beiden Protonen hier oben heraus gedrängt.
Die Aufnahme der beiden Protonen zur Wasserbildung führt also bereits hier zu einem Ausstoßen der Protonen
zum Zwecke einer ungestörten Ladungsumgebung.
Diese Hypothese ist meiner Ansicht nach die einfachste zur Erklärung eines Pumpenmechanismus,
kann aber sicherlich nicht allein unter dem Aspekt des Histidinzyklus formuliert werden;
wir müssen auch über Alternativen nachdenken.
Das ist die Elektronendichte für die oxidierte und die reduzierte Form.
Im Histidinzyklus sollten in der reduzierten Form nicht alle Histidinliganden vorliegen – sie liegen aber vor.
Daher handelt es sich hierbei meiner Ansicht nach um eines der grundlegenden Experimente,
die dafür sprechen, dass der Mechanismus des Histidinzyklus unwahrscheinlich ist.
Darüber hinaus habe ich große Probleme zu sehen,
wie ein positiv geladenes Histidin sein Proton nicht wieder auf eine reduzierte Sauerstoffspezies
im binuklearen Zentrum transportieren sollte.
Ich zeige Ihnen nun einige weitere interessante neue Details.
Wir befinden uns wieder im Herzen des Enzyms.
Sie sehen hier eine verzerrungsfreie Karte der Elektronendichte,
die mittels einer Technik namens “simulated annealing omit map” berechnet wurde.
In dem Modell werden sämtliche Reste herausgestrichen.
Es folgt eine simulierte Abkühlung, um eine Verzerrung zu erreichen.
Dann wird mit den neuen Phasen eine verzerrungsfreie Karte der Elektronendichte – hier dargestellt –
berechnet und das Modell neu aufgebaut.
Sie sehen hier das Modell von Häm A3; das ist das Eisen, das der Histidinligand des Eisens.
Hier erkennen Sie Kupfer B, hier den Histidinliganden von Kupfer B.
Das ist der dritte Ligand.
Zur allgemeinen Überraschung stellte sich heraus, dass ein benachbartes Tyrosin mit dem Histidin kovalent vernetzt ist.
Wir haben hier also eine unerwartete kovalente Vernetzung.
Natürlich entdeckt man solche Modifikationen nicht einfach bei der DNA-Sequenzierung,
dafür sind weiterführende Experimente notwendig.
Dies hat etwas zu bedeuten.
Meiner Ansicht bedeutet es in erster Linie, dass während der Reaktion eine so starke Oxidationskraft entsteht,
dass dadurch ein Elektron aus der Umgebung extrahiert wird; es entsteht ein Radikal.
Tyrosin bildet bekanntermaßen diese Art von Radikalen, und in einem Radikalmechanismus entsteht diese Form der Vernetzung.
Sie wurde bereits beobachtet, zwar nicht bei Histidinen, aber z.B. bei Cysteinen und anderen Resten in Peroxidasen.
Peroxidasen verfügen im Allgemeinen über eine ausreichende Oxidationskraft, um Radikale zu erzeugen,
die dann zu Vernetzungen in Proteinen führen.
Das heißt, hier liegt möglicherweise dieselbe Art von Reaktion vor.
Jetzt wird es etwas systematischer.
Dies ist der Katalysezyklus der Cytochrom C-Oxidase.
Er ist simpel.
Wir beginnen mit Sauerstoff, Eisen liegt in der +3-Form, Kupfer in der +2-Form vor.
Das erste aufgenommene Elektron geht auf das Kupfer über und wandelt es in Kupfer 1 um.
Es ist bekannt, dass dies mit der Aufnahme eines Protons einhergeht; dabei entsteht die um ein Elektron reduzierte Form.
Dann erfolgt die Aufnahme des zweiten Elektrons, begleitet von der Aufnahme eines Protons;
dabei wird die reduzierte Form Eisen +2, Kupfer +1 gebildet.
Bei der anschließenden alleinigen Aufnahme von Sauerstoff entsteht die so genannte Verbindung A,
die Britton Chance aus Philadelphia vor mehr als 20 Jahren entdeckte.
Dann bildet sich eine Verbindung namens P.
Man hielt P lange Zeit für eine Peroxyverbindung, zumindest eine ehemalige Peroxyverbindung, Eisen +3, Kupfer +2.
Doch die Elektronen werden von den Metallen auf den Sauerstoff übertragen.
Ich habe das immer für eine sehr unwahrscheinliche Struktur gehalten und mich gefragt, wie sie stabil sein kann.
Meine Skepsis wurde in der Tat durch ein kürzlich von dem Japaner Kitagawa durchgeführten Experiment bestätigt.
Er belegte mittels Resonanz-Raman-Spektroskopie eindeutig, dass bereits im P-Stadium eine gespaltene Sauerstoffverbindung,
nämlich ein Oxoferryl vorliegt, also ein per Doppelbindung an das Eisen gebundener Sauerstoff – Eisen +4,
Sauerstoff -2 in dieser Form und Kupfer +2.
Das würde aber bedeuten, dass hier ein Elektron fehlt.
Diese Verbindung muss also ein Elektron „stehlen“.
Möglicherweise wird das Elektron aus dem Rest abgezogen; Tyrosin ist da eine gute Erklärung.
Es wird auch diskutiert, dass Kupfer zu Kupfer +3 oder Eisen zu Eisen +5 werden könnte.
All das ist aber weniger wahrscheinlich als die Erklärung, dass das Elektron aus dem Tyrosin stammt
und so ein Tyrosinradikal entsteht.
Solche Theorien sind zwar im Gespräch, ich glaube aber,
dass diese Ursache im letzten Jahr erheblich weniger wahrscheinlich geworden ist.
Das ist also ein ziemlich neues Experiment.
Das Hauptproblem liegt jedoch darin, dass vor allem aus Wikströms Arbeiten in Helsinki bekannt ist,
dass die Protonenpumpe natürlich nur im Übergang vom P-Stadium zum F-Stadium tätig ist.
Dieses Stadium ist genau charakterisiert; es herrscht allgemeine Übereinstimmung,
dass es sich hier um das Oxoferrylstadium handelt.
Es ist auch bekannt, dass bei dieser Umwandlung die nächsten beiden Protonen durch die Membran gepumpt werden.
Bei dieser Art von Mechanismus hätten aber wir bereits einen Protonenpumpvorgang beobachten müssen.
Wir müssen also über einen Ausweg nachdenken, wenn sich keine Wassermoleküle bilden
und die eintretenden Protonen die während der Reaktion aufgenommenen Protonen ausstoßen.
Jetzt möchte ich aber noch einmal auf die Struktur zurückkommen.
Sie sehen hier rot dargestellt zusammen mit den Histidinliganden Häm A, das ist Häm A3.
Ich möchte folgenden Punkt besprechen:
Wo landen die bei der Reduktion aufgenommenen Protonen?
Ich denke, sie werden in diesem Bereich hier oben auf den Propionaten gespeichert.
Dort scheint eine rasche Protonenäquilibrierung zu erfolgen.
Später erfolgt die Aufnahme der Protonen.
Ich habe einen Mechanismus formuliert, der meiner Ansicht nach die verschiedensten Mechanismen einschließt.
Im Protein befinden sich, was ich bislang noch nicht erwähnt habe, zwei identifizierbare Protonentransferwege,
dieser hier mit Lycen und dieser hier mit Asparaginsäure am Anfang und Glutaminsäure am Ende.
Die Protonen werden meiner Ansicht nach während des Pumpens von der Glutaminsäure auf den Propionaten
in diesen Bereich transportiert.
Zur Sauerstoffbildung eintretende Elektronen werden aus diesem Bereich nach außen gedrängt, was den Pumpvorgang erklären würde.
Ich kann hier leider nicht weiter ins Detail gehen, um Ihnen diesen Zyklus zu erklären, es würde zu lange dauern.
Sie können mich aber gerne privat kontaktieren, wenn Sie das Thema vertiefen möchten.
Wir benötigen jedenfalls verschiedene Methoden, um das zu beweisen.
Daher stellten wir eine biosynthetische Mangelmutante für Häm A her, versetzten sie mit isotopenmarkierten Vorstufen,
so dass nur diese Kohlenstoffatome mit dem 13C von Häm A markiert werden,
und führten eine Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie durch.
Heute setzen wir noch ein anderes Verfahren ein und beobachten,
welche Veränderungen in den Vibrationsbanden bei der Reduktion auftreten.
Das steht für markiert bzw. unmarkiert;
Sie sehen die Unterschiede zwischen der markierten und der unmarkierten Cytochrom C-Oxidase.
Es gibt klare Unterschiede, die darauf hindeuten,
dass die Reduktion zu Veränderungen der Protonierungszustände und Konformation der Propionate führt.
Am Ende lässt sich dies in einer Art Mechanismus zusammenfassen, der auf rein elektrostatischen Grundlagen basiert.
Das ist heute unsere Arbeitshypothese, und wir arbeiten hart daran,
einen solchen Mechanismus im Detail zu beweisen bzw. zu widerlegen.
Doch zumindest haben Sie jetzt eine Vorstellung davon.
Das Ganze ist kompliziert; trotzdem müssen wir es verstehen und im Detail untersuchen.
Dafür benötigen wir all die Verfahren.
Die Botschaft für Sie, die Studenten, ist meiner Ansicht nach, dass Sie alle Methoden kennen müssen,
um sie bei der Lösung biologischer Problem effizient einsetzen zu können.
Zum Schluss möchte ich noch den Mitgliedern meiner Arbeitsgruppe danken:
Gerald Kleymann, der das Verfahren der Antikörperfragmentproduktion im Labor entwickelte,
Christian Ostermeier, der den Großteil der Kristallisationsarbeiten durchführte und die zweite Kristallstruktur bestimmte,
Hanni Müller, die den Großteil des Materials isolierte,
So Iwata, der in sehr kurzer Zeit die Proteinstruktur aufklärte,
Axel Harrenga, der diese Struktur verbesserte, so dass wir jetzt über eine erheblich bessere Struktur verfügen,
Aimo Kannt, der elektrostatische theoretische Berechnungen durchführte, die ich heute nicht erwähnt habe,
und Julia Behr, die zusammen mit Werner Mäntele und Petra Hellwig von der Universität München
an den Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie-Studien beteiligt war.
Die Mutantenstudien wurden z.T. von unseren biochemischen Kollegen Bernd Ludwig und Heike Witt
von der Universität Frankfurt durchgeführt.
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit.
